響應面優(yōu)化金銀花綠原酸提取工藝及抗氧化作用研究

石艷賓，李文靜

（1.天津天獅學院，天津301700；2.天津嘉匯捷瑞醫(yī)藥科技有限公司，天津301800）

金銀花（Lonicera japonica）是忍冬初開的花或干燥的花蕾，具有抗病原微生物、抗炎、解熱、保肝、降血脂、止血、免疫調節(jié)等作用，臨床主要用于治療各種感染、炎癥、高血脂、腫瘤放療等[1-2]。綠原酸是金銀花中典型的抗氧化功效成分，有很強的藥理活性，對血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效[3-4]。蘆丁是典型黃酮類抗氧化物質，能降低炎癥，有抗病毒和抗氧化作用，可用于防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癜和急性出血性腎炎等疾病[5-6]。劉亞敏等利用正交試驗優(yōu)選山銀花綠原酸提取工藝條件，指出山銀花綠原酸提取物具有較好的自由基清除能力[7]。Tingting Cui 等[8]應用Box-Behnken 分析萃取溫度、乙醇濃度、浸泡時間對金銀花綠原酸提取率的影響，優(yōu)化綠原酸提取條件為提取溫度80 ℃、乙醇濃度為70.37%、浸泡時間為9.35 h。蔣美麗等分析超聲輔助乙醇提取金銀花綠原酸，提出料液比、時間對綠原酸提取率有顯著性影響[9]。研究表明[10-12]，黃酮類物質間、多酚類物質間、番茄紅素與甘草黃酮、VE間存在一定程度的協(xié)同抗氧化作用，但對酚類物質與黃酮類物質間的抗氧化協(xié)同作用研究的較少。本文利用響應面軟件優(yōu)化金銀花綠原酸超聲波輔助法提取工藝條件，評價金銀花綠原酸提取物的抗氧化性，分析酚型抗氧化物質綠原酸與黃酮類抗氧化物質蘆丁間的協(xié)同抗氧化作用，符合復配抗氧化劑的發(fā)展趨勢，為天然產(chǎn)物的深度開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠原酸標準品（純度≥98%）、蘆丁標準品（純度≥98%）：中國食品藥品檢定研究院；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）：sigma 公司；維生素 C、無水乙醇：分析純，天津江天化工技術有限公司；金銀花（水分含量7 %）：市售。

1.2 儀器與設備

AL204 分析天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；UV1000 紫外可見分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；KM-5200DE 超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；TD5K-Ⅲ低速離心機：長沙東旺實驗儀器有限公司；XL-60C 賽多利高速萬能粉碎機：上海恒科實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金銀花綠原酸的提取工藝

準確稱取粉碎處理金銀花樣品2 g 于250 mL 磨口三角瓶中，加入乙醇溶液進行超聲輔助提取。金銀花綠原酸提取液離心機轉速5 000 r/min 離心處理20 min，傾出上清液用蒸餾水定容至100 mL 容量瓶，搖勻待測。

1.3.2 綠原酸標準曲線的測定

吸取一定量濃度為117 μg/mL 綠原酸標準溶液于25 mL 容量瓶中，配制成濃度依次為 0、4.68、9.36、14.04、18.72、23.40、28.08 μg/mL 綠原酸標準品待測溶液，以零管為空白，在波長328 nm 處測定標準溶液的吸光度值。以綠原酸標準溶液的濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，制作綠原酸標準曲線，得回歸方程y=0.048 0x-0.005 0 和相關系數(shù)R2=0.998 9，金銀花樣品中綠原酸按照下面公式計算。

綠原酸提取率/%=（提取液的濃度×稀釋倍數(shù)×100/樣品質量）×100

1.3.3 單因素試驗

準確稱取經(jīng)預處理的金銀花粉2 g，置于250 mL磨口三角瓶中，在其他條件相同的情況下，采用不同乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間進行金銀花綠原酸超聲輔助提取。以金銀花綠原酸提取率為考核指標，比較各因素的條件變化對綠原酸提取率的影響，確定各因素的優(yōu)水平。

1.3.4 響應面試驗優(yōu)化金銀花綠原酸的提取工藝

基于金銀花綠原酸單因素試驗的結果，以乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間為影響因素，以綠原酸提取率為考核指標，應用SAS9.3 軟件設計四因素三水平響應面試驗，試驗因素與水平設計如表1 所示。

表1 綠原酸響應面法提取試驗的因素與水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken design of chlorogenic acid

1.3.5 金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力的測定

1.3.5.1 金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力測定

準確稱取23.6 mg DPPH 試劑，用70%甲醇溶液配制成6×10-4（mol/L）DPPH 溶液，作為母液于冰箱冷藏備用。使用時從母液中吸取10 mL，用70%甲醇溶液定容至100 mL 的容量瓶中，作為DPPH 自由基測定的反應試劑[12-13]。將綠原酸提取物、蘆丁、VC配制成適宜濃度的待測系列樣品溶液，測定DPPH 自由基清除率，并以VC對DPPH 自由基清除效果為對照，評價金銀花綠原酸提取物、蘆丁的抗氧化活性。分別移取0.6 mL綠原酸提取物、蘆丁、VC待測樣品溶液于棕色比色管中，加入6×10-5（mol/L）DPPH 甲醇溶液6 mL，混合搖勻、靜置反應30 min 后，在517 nm 處測定反應后的吸光度Ar。70%甲醇溶液與DPPH 溶液反應的吸光度為空白對照Ac，綠原酸提取物、蘆丁、VC樣品溶液與甲醇溶液對應的吸光度為A0，DPPH 自由基清除率計算公式如下：

1.3.5.2 金銀花綠原酸、蘆丁協(xié)同抗氧化能力測定

在金銀花綠原酸、蘆丁抗氧化能力分析的基礎上，將金銀花綠原酸提取物與蘆丁按1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 體積比進行混合，依據(jù)上述試驗方法方依次測定A0、Ar、Ac值，計算復配溶液抗氧化協(xié)同系數(shù)（SE），分析金銀花綠原酸與蘆丁協(xié)同清除DPPH 自由基的效果。抗氧化協(xié)同系數(shù)SE 為復合溶液測定的清除率（ESC）和理論清除率（TSC）之間的比值。當SE＜1，綠原酸提取物與蘆丁間沒有明顯的協(xié)同作用；SE＞1，表示二者間具有協(xié)同作用。理論清除能力（TSC）的計算如下：

式中：ESC1為復合溶液中綠原酸的試驗測定清除率，%；ESC2為復合溶液中蘆丁試驗清除率，%。

1.4 試驗數(shù)據(jù)處理方法

單因素試驗平行3 次，采用EXCEL 進行單因素試驗數(shù)據(jù)處理，應用SAS.9.3 軟件進行優(yōu)化提取工藝條件及方差分析。

2 結果與分析

2.1 金銀花綠原酸提取單因素試驗

2.1.1 乙醇濃度對綠原酸提取率的影響

在料液比 1 ∶20（g/mL）、超聲溫度 30 ℃、超聲時間20 min 的條件下，考察不同提取溶劑乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對金銀花綠原酸提取效果的影響，結果如圖1 所示。

圖1 乙醇濃度對金銀花綠原酸提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由圖1 可知，金銀花綠原酸的提取率隨著乙醇濃度的升高逐漸增加，當乙醇濃度為70%時金銀花綠原酸提取率最高。繼續(xù)增大乙醇溶液濃度，可能是由于一些醇溶性雜質、色素、親脂性強的成分溶出量增加，競爭與乙醇、水分子結合，導致綠原酸提取率出現(xiàn)下降現(xiàn)象，故確定金銀花綠原酸提取溶劑乙醇濃度為70%。

2.1.2 料液比對綠原酸提取率的影響

在超聲溫度30 ℃、超聲時間20 min、乙醇濃度70 %的條件下，考察料液比 1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）對金銀花綠原酸提取率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對金銀花綠原酸提取率的影響Fig.2 Effect of solid/liquid ratio on the yield of Lonicera japonica chlorogeni cacid

綠原酸提取率隨溶劑體積的增加而增大，當料液比增加至1 ∶20（g/mL）后金銀花中綠原酸的提取率達到最大值，隨后變化基本趨于不變。提取溶劑量越大，提取效果越好，但過多的提取溶劑使有些難溶出的物質有可能被提取出來，對綠原酸的提取造成干擾，也會對后處理工序造成麻煩及能源浪費。因此，確定料液比 1 ∶20（g/mL）較為適宜。

2.1.3 超聲溫度對綠原酸提取率的影響

在超聲時間 20 min、料液比 1 ∶20（g/mL）、乙醇濃度 70%的條件下，考察超聲溫度（30、40、50、60、70 ℃）對金銀花綠原酸提取率的影響，結果見圖3。

圖3 超聲溫度對金銀花綠原酸提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

金銀花綠原酸提取率在30 ℃至40 ℃時，隨溫度升高而上升；在40 ℃至70 ℃之間，隨著溫度的升高綠原酸提取率反而出現(xiàn)下降趨勢。提取溫度的升高可增大綠原酸的溶出量，但溫度過高可能導致綠原酸的結構被破壞，導致提取率降低。因此，金銀花綠原酸提取的較適宜溫度為40 ℃。

2.1.4 超聲時間對綠原酸提取率的影響

在乙醇濃度 70%、料液比 1 ∶20（g/mL）、超聲溫度40 ℃的條件下，考察超聲時間（10、20、30、40、50 min）對金銀花綠原酸提取率的影響，結果見圖4。

圖4 超聲時間對金銀花綠原酸提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the yield of Lonicera japonica chlorogenic acid

由圖4 可知，金銀花綠原酸提取率隨時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，超聲提取20 min 時綠原酸提取率最高。綠原酸提取率在提取時間大于20 min 后出現(xiàn)下降趨勢，可能提取時間延長使部分綠原酸結構破壞，從而導致綠原酸提取率降低。因此，選擇20 min為金銀花綠原酸的較適宜提取時間。

2.2 響應面優(yōu)化金銀花綠原酸提取條件

2.2.1 金銀花綠原酸響應面提取試驗結果

依據(jù)金銀花綠原酸提取的單因素試驗結果，應用SAS9.3 軟件實施四因素三水平的響應面試驗，分析乙醇濃度、料液比、溫度、時間對金銀花綠原酸提取率的影響，響應面試驗結果詳見表2。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Results of Box-Benhnken design

續(xù)表2 響應面試驗方案及結果Continue table 2 Results of Box-Benhnken design

2.2.2 響應面試驗結果方差分析

根據(jù)表2 試驗結果進行金銀花綠原酸提取的響應面方差分析，詳見表3。

表3 響應面法試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of Box-Benhnken design

由表3 可知，C、D、BC 對綠原酸提取的影響顯著，B、A2、B2、C2、CD、D2對提取的影響非常顯著。由 F 值的大小可以推斷出，這4 個因素在所規(guī)定的范圍內對金銀花綠原酸提取的影響程度依次為B（料液比）＞C（超聲溫度）＞D（超聲時間）＞A（乙醇濃度）。

應用SAS9.3 軟件進行響應面回歸分析，對乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度4 個因素進行回歸擬合，得到多元響應面回歸模型：Y=-15.312 2+0.360 5A+0.415 167B + 0.207 167C - 0.066 25D - 0.001 237A2-0.000 45AB-0.001 125AC+0.000 375AD-0.007 3B2+0.002 9BC + 0.000 25BD - 0.001 662C2+ 0.001 85CD -0.001 175D2。回歸模型P=0.000 2＜0.01，失擬項P=0.205 8＞0.05，說明回歸方程顯著、失擬項不顯著，響應面回歸方程的擬合程度良好。

2.2.3 響應面圖分析

應用SAS9.3 對表3 數(shù)據(jù)進行分析，繪制出響應曲面圖5～圖10。

圖5 乙醇濃度與料液比對綠原酸提取的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration and liquid ratio on the yield of chlorogenic acid

圖6 乙醇濃度與超聲溫度對綠原酸提取的影響Fig.6 Effect of ethanol concentration and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

圖7 乙醇濃度與超聲時間對綠原酸提取的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

圖8 料液比與超聲溫度對綠原酸提取的影響Fig.8 Effect of liquid ratio and ultrasonic temperature on the yield of chlorogenic acid

圖9 料液比與超聲時間對綠原酸提取的影響Fig.9 Effect of liquid ratio and ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid

根據(jù)響應面回歸方程及響應曲面圖，因素BC、CD的交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為乙醇濃度 68.9%、料液比 1 ∶22.8（g/mL）、超聲溫度43.6 ℃、超聲時間19.8 min。為了便于控制金銀花綠原酸提取條件，提取參數(shù)設置為乙醇濃度69%、料液比 1 ∶23（g/mL）、超聲溫度 44 ℃、超聲時間 20 min，進行綠原酸提取的3 次平行驗證試驗。依據(jù)試驗方法1.2.1 和1.2.2 金銀花綠原酸提取率平均值為6.20%，均高于響應面試驗結果，故確定此方案為優(yōu)化方案。

圖10 超聲溫度與超聲時間對綠原酸提取的影響Fig.10 Effect of ultrasonic temperature and ultrasonictime on the yield of chlorogenic acid

2.3 金銀花綠原酸抗氧化能力分析

2.3.1 金銀花綠原酸提取物的抗氧化能力評價

測定VC溶液、金銀花綠原酸提取液、蘆丁溶液系列濃度下DPPH 自由基清除率繪制濃度-清除率，見圖11，計算抗氧化樣品溶液的半數(shù)清除率IC50值、回歸方程，詳見表4。

圖11 VC、綠原酸和蘆丁對DPPH 自由基的清除作用Fig.11 Scavenging effect on DPPH free radical of VC，chlorogenic acid and rutin

表4 VC、綠原酸和蘆丁回歸方程與IC50 值Table 4 Regression equation and IC50 on antioxidants of VC，chlorogenic acid and rutin

由圖11、表4 可知，金銀花綠原酸、VC、蘆丁都具有較強的DPPH 自由基清除能力，且清除能力隨著抗氧化樣品溶液濃度的增大而增強。通過比較三者的半數(shù)清除率IC50值可知，金銀花綠原酸抗氧化能力略強于VC，蘆丁相比綠原酸、VC，抗氧化能力較差。

2.3.2 蘆丁與綠原酸的協(xié)同作用

依據(jù)試驗方法1.3.5，將濃度為30 μg/mL 金銀花綠原酸和蘆丁樣品溶液，按照復配體積比為1 ∶1、1 ∶3、3 ∶1、1 ∶9、9 ∶1 進行混合，測定金銀花綠原酸提取液與蘆丁溶液的混合液DPPH 自由基清除率，分析二者間協(xié)同抗氧化效果，結果見圖12。

圖12 綠原酸與蘆丁的協(xié)同抗氧化作用Fig.12 Synergistic antioxidant effect of chlorogenic acid and rutin

通過計算協(xié)同系數(shù)SE，分析5 種不同混合溶液抗氧化效果，金銀花綠原酸與蘆丁配比為9 ∶1 時SE 為1.05，均高于其他4 種混合溶液，協(xié)同增效作用明顯。

3 結論

應用SAS9.3 軟件建立金銀花綠原酸提取的多項回歸方程模型，方程擬合良好。在確定的4 個因素水平范圍內，對金銀花綠原酸提取的影響程度依次為B＞C＞D＞A，因素 BC、CD 交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為乙醇濃度69 %、料液比1 ∶23（g/mL）、超聲溫度 44 ℃、超聲時間 20 min，驗證結果為6.20%，與理論預測值接近，表明多項回歸模型能較好的對金銀花綠原酸的輔助提取進行預測。金銀花綠原酸DPPH 自由基的半數(shù)清除率為21.09 μg/mL，具有明顯的抗氧化活性。金銀花綠原酸與蘆丁具有一定的協(xié)同作用，復配比例9 ∶1 時SE 值為1.05，兩者間協(xié)同增效作用明顯。