蚌肉肽—鋅螯合物制備工藝及其保肝作用研究

王常瞵 王升光 劉曉美 代 龍 高 鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

蚌為軟體動物門瓣鰓綱蚌科，多個品種能在淡水中用于養(yǎng)殖生產(chǎn)珍珠。由于蚌肉蛋白呈角質(zhì)化，不易嚼碎、消化，因此在取珠后多被廢棄，造成極大的資源浪費及環(huán)境污染問題[1-2]。河蚌肉蛋白質(zhì)含量豐富、脂肪含量低，含有較多的核黃素，具有解酒、保肝、提高免疫力等功效[3-5]。

劉仁平等[6]發(fā)現(xiàn)蚌肉可明顯改善肝細(xì)胞的水樣變和脂肪變，阻遏炎性反應(yīng)。民間自古就有“蚌肉煮水代茶飲來解酒毒，保肝護肝”的習(xí)俗。鋅被近代醫(yī)學(xué)界、營養(yǎng)學(xué)界喻為人體的“生命之花”，對人體中的脂肪、糖類和蛋白質(zhì)起調(diào)節(jié)作用[7-8]。 富鋅蚌肉肽不僅能發(fā)揮蚌肉的保肝護肝作用，且能作為補鋅劑，提高鋅元素的生物利用率[9]10-12。目前研究[10-12]主要集中在采用超聲波—微波或高壓脈沖電場輔助酶解蚌肉并對其工藝進行優(yōu)化，在蚌肉肽螯合微量元素及其保肝作用方面研究較少，劉佳彤[13]采用蚌肉酶解制得的氨基酸與蚌殼提取的可溶鈣直接螯合制備可食性氨基酸螯合鈣；周龍[9]15-21將蚌肉通過蛋白酶水解成分子量較小的多肽分子，在一定條件下，與無機鋅鹽絡(luò)合產(chǎn)生多肽鋅螯合物并制備了多肽鋅制劑，但均未涉及螯合物的藥效作用。

試驗擬以河蚌肉為原料，通過最佳酶解工藝制備活性肽，再與微量元素鋅相螯合，通過響應(yīng)面法優(yōu)化螯合工藝得到富鋅蚌肉肽并評價其保肝作用，旨在加大蚌肉的深入開發(fā)研究，為蚌肉護肝制品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料、動物與試劑

河蚌肉：浙江省諸暨市養(yǎng)殖場；

KM小鼠：100只，雌雄各半，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司；

堿性蛋白酶、胰蛋白酶等：酶活≥1.0×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

組織搗碎機：DS-1型，無錫沃信儀器有限公司；

膠體磨：JM-L50型，上海諾尼輕工機械有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50FBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

pH計：FE-20型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

離心機：DT5-2型，北京時代北利離心機有限公司；

冷凍干燥機：JM-L50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

磁力攪拌器：CL-85-2型，江蘇金怡儀器科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：R-301型，上海申順生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蚌肉肽的制備 將河蚌肉洗凈，加入少量純水用組織搗碎機高速搗碎，加入適量的純水使底物濃度為10%，膠體磨對其進行勻漿處理，煮沸20 min，進行高溫殺菌，待溫度升至45 ℃，調(diào)節(jié)pH至8.0，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的堿性蛋白酶和胰蛋白酶(即加酶量占生藥量的百分比)酶解3 h后，煮沸，高溫滅酶15 min，迅速冷卻至室溫，于冰箱冷藏過夜，4 500 r/min離心10 min，取上清液，濃縮，-24 ℃預(yù)冷凍5 h(或-80 ℃預(yù)冷凍1 h)，冷凍干燥，得蚌肉肽凍干粉。

1.3.2 蚌肉肽—鋅螯合單因素試驗

(1) 時間：將蚌肉肽與鋅溶液按質(zhì)量濃度比2∶1 (g/mL)混合均勻，螯合pH 8.0，螯合溫度70 ℃，分別螯合反應(yīng)0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，考察螯合時間對螯合率的影響。

(2) 螯合溫度：將蚌肉肽與鋅溶液按質(zhì)量濃度比2∶1 (g/mL)混合均勻，螯合pH 8.0，螯合溫度分別為50，60，70，80，90 ℃，螯合反應(yīng)2 h，考察螯合溫度對螯合率的影響。

(3) 蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比：將蚌肉肽與鋅溶液分別按質(zhì)量濃度比1∶2，2∶2，3∶2，4∶2，5∶2 (g/mL)混合均勻，螯合pH 8.0，螯合溫度70 ℃，螯合反應(yīng)2 h，考察蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比對螯合率的影響。

(4) pH值：將蚌肉肽與鋅溶液按質(zhì)量濃度比2∶1 (g/mL) 混合均勻，螯合pH分別為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，螯合溫度70 ℃，螯合反應(yīng)2 h，考察pH對螯合率的影響。

1.3.3 蚌肉肽—鋅螯合響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，選取螯合時間、螯合溫度、蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量比及pH值為因素，以螯合率為響應(yīng)值，采用四因素三水平進行響應(yīng)面分析試驗。

1.3.4 螯合率的測定 采用乙二胺四乙酸(EDTA)絡(luò)合滴定法[14]。

1.3.5 保肝作用研究

(1) 小鼠CCl4急性肝損傷模型的建立：根據(jù)文獻[15],將KM小鼠隨機分成7組，每組10只，分別為正常對照組、CCl4模型組、蚌肉肽組、富鋅蚌肉肽低劑量組、富鋅蚌肉肽中劑量組、富鋅蚌肉肽高劑量組、陽性對照水飛薊素組。各組均以小鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，25 ℃下適應(yīng)1周后，正常對照組和CCl4模型組按10 mL/kg·BW劑量每天灌胃生理鹽水1 次，蚌肉肽組按200 mg/kg·BW劑量每天灌胃蚌肉肽樣品1 次，富鋅蚌肉肽低、中、高劑量組分別按100，200，400 mg/kg·BW劑量每天灌胃富鋅蚌肉肽樣品1次，陽性對照組按50 mg/kg·BW劑量每天灌胃水飛薊素1次。灌胃15 d后，正常對照組腹腔注射10 mL/kg·BW劑量橄欖油，其余組注射體積分?jǐn)?shù)為0.125% CCl4—橄欖油溶液10 mL/kg·BW。

(2) 生化指標(biāo)檢測：根據(jù)文獻[16]按試劑盒說明書方法測定肝組織勻漿中SOD、GSH-Px活力。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚌肉肽—鋅螯合工藝優(yōu)化

2.1.1 螯合時間對螯合率的影響 由圖1可知，螯合率隨螯合反應(yīng)的進行先快速增加后趨于平穩(wěn)。可能是反應(yīng)前期肽與鋅接觸面積大，反應(yīng)快，后期反應(yīng)逐漸達飽和，螯合率基本不變，因此最佳螯合時間為2 h。

2.1.2 螯合溫度對螯合率的影響 由圖2可知，螯合率隨螯合溫度的升高先增加后減小，可能是溫度過高，部分螯合物不穩(wěn)定[17]，故最佳螯合溫度為70 ℃。

2.1.3 蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比對螯合率的影響 由圖3可知，螯合率隨蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比的增加先增加后趨于平穩(wěn)，可能是前期肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比逐漸增大有利于生成穩(wěn)定的螯合物，螯合率增加，但蚌肉肽濃度過大，溶解度降低，所以最佳質(zhì)量濃度比為2∶1 (g/mL)。

圖1 螯合時間對蚌肉肽—鋅螯合的影響

Figure 1 Effect of chelating time on chelating technology of mussel meat peptide-Zinc

圖2 螯合溫度對蚌肉肽-鋅螯合的影響

Figure 2 Effect of chelating temperature on chelating technology of mussel meat peptide-Zinc

圖3 蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比對蚌肉肽—鋅螯合的影響

Figure 3 Effect of mussel meat peptide and zinc concentration ratio on chelating technology of mussel meat peptide-Zinc

2.1.4 pH值對螯合率的影響 由圖4可知，螯合率隨pH的增加先增加后減少，pH為8.0時可能接近螯合物等電點，受酸堿影響較小[18]，螯合率最高。

圖4 pH值對蚌肉肽-鋅螯合的影響

Figure 4 Effect of chelating pH value on chelating technology of mussel meat peptide-Zinc

2.1.5 蚌肉肽—鋅螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗 根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理進行優(yōu)化試驗，因素設(shè)計及方案見表1，試驗及結(jié)果見表2，方差分析見表3。

各因素與螯合率之間的多元二次響應(yīng)面回歸模型為：

(1)

表1螯合工藝響應(yīng)面試驗水平編碼表

Table1Responsesurfacetestlevelandcodingtableofchelatingprocess

水平X1螯合時間/hX2螯合溫度/℃X3蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比(g/mL)X4 pH-11.0603︰27.001.5704︰28.012.0805︰29.0

表2響應(yīng)面組合設(shè)計試驗及結(jié)果

Table2Responsesurfacecombineddesigntestandresults

試驗號X1X2X3X4螯合率/%10-11041.352000055.23301-1038.174-110049.735000058.426101046.0870-1-1035.198010-133.729-100-134.5910001129.021100-1124.081200-1-123.9813100-135.08141-10049.2615110051.7216-100134.5217010133.6218-1-10047.8619000060.06200-10131.59210-10-131.4722-10-1039.5623000058.5524100135.8925-101054.292610-1041.1227001-138.5728000058.2529011043.29

表3 回歸模型方差分析結(jié)果?

由圖5可知，螯合溫度與螯合時間兩因素交互作用較強，但由方差分析結(jié)果可知，兩因素間交互作用對螯合率影響并不顯著；螯合溫度與蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比兩因素交互作用較強，隨著螯合溫度和蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比的增加，螯合率先增大后減小，與溫度過高，螯合物穩(wěn)定性受影響有關(guān)；螯合溫度與pH兩因素交互作用較強，隨著螯合溫度和pH的增加，螯合率先逐漸增大后減少，可能是溫度升高，螯合率增加過快，當(dāng)溫度過高時螯合反應(yīng)受限制；pH與蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比兩因素交互作用較強，隨著pH和蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比的增加，螯合率逐漸增大，進一步增加時，螯合率又減少。

2.1.6 最佳螯合工藝驗證實驗 經(jīng)優(yōu)化最佳螯合工藝為：螯合溫度70 ℃，pH 8.0，蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比2∶1 (g/mL)，螯合反應(yīng)1.5 h，該條件下響應(yīng)面分析預(yù)測螯合率為58.61%，實測螯合率為58.55%(n=3)，相對誤差<5%，表明此模型可行有效。

圖5 不同螯合因素對蚌肉肽-鋅螯合率影響的響應(yīng)曲面

2.2 保肝作用研究

由表4可知，與正常對照組相比，CCl4模型組小鼠肝組織中SOD活性、GSH-Px活性有極顯著差異(P<0.01)；與CCl4模型組相比，蚌肉肽組SOD、GSH-Px活性顯著升高(P<0.05)，富鋅蚌肉肽各劑量組SOD、GSH-Px活性均極顯著升高(P<0.01)，且呈劑量—效應(yīng)關(guān)系，表明蚌肉肽具有良好的保肝作用但作用較富鋅蚌肉肽稍差；與陽性對照組水飛薊素組相比，灌胃高劑量組SOD、GSH-Px活性相當(dāng)，表明富鋅蚌肉肽具有良好的保肝效果。

表4不同組別對CCl4肝損傷小鼠肝勻漿中SOD、GSH-Px的影響?

Table4EffectsofdifferentgroupsonSODandGSH-PxinliverhomogenateofCCl4liverinjuredmice(n=10)

組別劑量/(mg·kg-1·BW)SOD/(IU·L-1)GSH-Px/(IU·L-1)正常對照組-139.15±4.56 287.45±9.56 CCl4模型組-107.98±2.35190.68±7.24蚌肉肽組200117.23±2.78?217.33±8.58?富鋅蚌肉肽低劑量組100129.55±3.48??230.47±5.51??富鋅蚌肉肽中劑量組200134.16±6.29??244.73±4.88??富鋅蚌肉肽高劑量組400142.78±7.73??258.16±8.52??陽性對照水飛薊素組50140.62±6.77??251.21±7.29??

? *表示P<0.05；**表示P<0.01。

3 結(jié)論

采用最佳酶解工藝制備出蚌肉肽，以螯合率為指標(biāo)，對蚌肉肽—鋅螯合物的制備工藝進行了研究，通過單因素試驗及響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得出蚌肉肽—鋅的最佳螯合工藝參數(shù)為螯合溫度70 ℃，pH 8.0，蚌肉肽與鋅溶液質(zhì)量濃度比2∶1(g/mL)，螯合反應(yīng)1.5 h，螯合率為58.55%。對小鼠CCl4肝損傷模型進行藥效學(xué)試驗應(yīng)用研究可知，富鋅蚌肉肽具有較好的保護肝臟作用。由于時間限制，藥效學(xué)跟蹤還需進一步進行；富鋅蚌肉肽穩(wěn)定性仍需進一步研究。