基于SSR分子標(biāo)記的普通菜豆種質(zhì)遺傳多樣性分析

夏春陽(yáng) 杜吉到 韓毅強(qiáng) 孫浩月 李 明 吳洪斌 張 琦 于晟龍

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 大慶 163319)

普通菜豆又名蕓豆、四季豆，屬豆科蝶形花亞科菜豆族菜豆屬菜豆種，是菜豆屬重要的栽培種之一[1]。中國(guó)普通菜豆的主產(chǎn)區(qū)主要分布在黑龍江、內(nèi)蒙古、吉林、云南、貴州、山西、陜西等地。普通菜豆適應(yīng)性強(qiáng)在世界范圍內(nèi)均有種植，是最受消費(fèi)者歡迎的食用豆類作物之一[2]，成熟普通菜豆經(jīng)過(guò)加工后可以制成豆沙或者糕點(diǎn)等，未達(dá)到成熟時(shí)期的可作為蔬菜食用。普通菜豆籽粒中蛋白質(zhì)含量為17%～23%，脂肪含量為1.3%～2.6%，碳水化合物含量為56%～61%[3]，還含有礦物質(zhì)以及多種維生素，在欠發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，菜豆可供人們直接食用，并且是人們膳食結(jié)構(gòu)中重要的組成部分[4-5]。

目前中國(guó)對(duì)菜豆種質(zhì)資源研究包括對(duì)現(xiàn)有的資源進(jìn)行系統(tǒng)的形態(tài)鑒定；對(duì)部分菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行抗病蟲、抗逆性試驗(yàn)鑒定，首先篩選出一部分優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源，對(duì)菜豆特殊功能成分進(jìn)行提取及分析[6]。Lei等[7]對(duì)233份菜豆進(jìn)行形態(tài)多樣性鑒定，并篩選出183份優(yōu)異種質(zhì)。Blair等[8]和欒非時(shí)等[9]分別對(duì)323份蕓豆和60份蕓豆基于形態(tài)性狀進(jìn)行聚類分析，分別劃出2個(gè)類群與3個(gè)類群。遺傳多樣性是指在群體內(nèi)個(gè)體間基因組成的差異，這是一個(gè)種群和一個(gè)物種中的遺傳基礎(chǔ)，一個(gè)種群的遺傳多樣性越豐富，種質(zhì)資源對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)力越強(qiáng)，更容易擴(kuò)展分布的范圍和開(kāi)拓新環(huán)境[10]。分子標(biāo)記是DNA水平遺傳變異的直接反映，新的DNA標(biāo)記技術(shù)如簡(jiǎn)單重復(fù)序列(SSR)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)擴(kuò)增片段多態(tài)性(AFLP)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記(ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等分子標(biāo)記技術(shù)不斷涌現(xiàn)應(yīng)用，已成為現(xiàn)代作物育種領(lǐng)域的研究?jī)?nèi)容與技術(shù)手段。SSR標(biāo)記與RAPD、RFLP等分子標(biāo)記相比，SSR具有共顯性、豐富的多態(tài)性、高度的穩(wěn)定性，簡(jiǎn)便的操作性等優(yōu)點(diǎn)[11]。為了更好地利用菜豆的種質(zhì)資源，利用SSR分子標(biāo)記對(duì)菜豆進(jìn)行遺傳多樣性分析，得到相關(guān)數(shù)據(jù)從而判斷其遺傳關(guān)系，有助于菜豆優(yōu)勢(shì)基因的挖掘和種質(zhì)材料的利用。目前SSR分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水稻[12]、小麥[13]、玉米[14]等大田作物。張赤紅等[15]基于SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)377份菜豆進(jìn)行了遺傳多樣性評(píng)價(jià)并予以分類。試驗(yàn)擬利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)普通菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性研究，探討DNA水平上的遺傳差異和遺傳結(jié)構(gòu)，分析普通菜豆種質(zhì)資源的遺傳多樣性豐富程度，為保護(hù)菜豆種質(zhì)資源保護(hù)和研究利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菜豆(見(jiàn)表1)：國(guó)家雜糧技術(shù)中心種質(zhì)資源庫(kù)。

1.2 普通菜豆基因組DNA提取和檢測(cè)

普通菜豆種子在室溫下種植，取生長(zhǎng)至3周葉齡葉片采用CTAB法提取基因組DNA，利用核酸蛋白定量檢測(cè)儀和1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總DNA的質(zhì)量和濃度。濃度稀釋至100 ng/μL，-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)和篩選

32對(duì)試驗(yàn)引物參照文獻(xiàn)[15-16]設(shè)計(jì)，以參試材料基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以條帶清晰、多態(tài)性好、方便統(tǒng)計(jì)、穩(wěn)定性好的SSR引物作為核心引物。

1.3.1 PCR擴(kuò)增

(1) PCR反應(yīng)體系：Taq酶(1.25 U) 0.1 μL，1.6 μL dNTP (2.5 mmol/L)，1 μL模板DNA(100 ng/μL)，1 μL上、下游引物(10 μmol/L)，2 μL 10×Taq Buffer，用超純水將體積補(bǔ)齊至20 μL。

(2) PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，依據(jù)各引物退火溫度復(fù)性30 s，延伸溫度72 ℃延伸40 s，設(shè)置30個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸7 min。

1.3.2 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè) 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)，電泳結(jié)束后對(duì)凝膠結(jié)果進(jìn)行快速銀染檢測(cè)。

(1) 灌膠：用8%的變性聚丙烯酰胺灌膠，防止出現(xiàn)氣泡，輕輕插入梳子，使其聚合1.5 h左右。

(2) 電泳：清除氣泡及殘膠，插入樣品梳子，接通電源，170 W恒功率電泳，預(yù)電泳10 min。每一個(gè)加樣孔點(diǎn)入5 μL 樣品。電泳2 h，電泳結(jié)束后小心分開(kāi)兩塊玻璃板。

(3) 固定：50%無(wú)水乙醇+2%冰醋酸，輕輕晃動(dòng)3 min。

(4) 漂洗：蒸餾水快速漂洗1次，不超過(guò)15 s。

(5) 顯影：1.6% NaOH+0.4%甲醛顯影，輕輕晃動(dòng)至條帶出現(xiàn)(膠背景為蛋黃色)。

1.4 數(shù)據(jù)記錄和統(tǒng)計(jì)分析

采用手動(dòng)讀帶法，統(tǒng)計(jì)清晰穩(wěn)定、有差異的條帶，有帶記為1，無(wú)帶記為0。用PopGene32v1.32軟件計(jì)算各SSR引物的等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量值(PIC)、Shannon’s多樣性指數(shù)。用NT-SYS計(jì)算品種間的相似系數(shù)，按類平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析，繪制品種間的親緣關(guān)系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性引物的篩選

利用69份普通菜豆種質(zhì)資源材料對(duì)32對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，最終獲得17對(duì)條帶清晰、多態(tài)性好、方便統(tǒng)計(jì)、穩(wěn)定性好的SSR引物用于對(duì)69份普通菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析。引物BM170的PAGE電泳效果圖如圖1。

表1 69份供試材料

2.2 普通菜豆種質(zhì)間的遺傳多樣性分析

利用PopGene32v1.32軟件對(duì)69份普通菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析見(jiàn)表2。經(jīng)多態(tài)性分析結(jié)果顯示：17對(duì)SSR標(biāo)記共檢測(cè)獲得等位變異位點(diǎn)55個(gè)，變幅2～5個(gè)，平均每對(duì)檢測(cè)到標(biāo)記3.24個(gè)。其中標(biāo)記BM143、BM141檢測(cè)到的變異位點(diǎn)數(shù)最高為5個(gè)位點(diǎn)，標(biāo)記BM183、DH2檢測(cè)到的變異位點(diǎn)數(shù)最少為2個(gè)位點(diǎn)，其余標(biāo)記皆檢測(cè)到3～4個(gè)變異位點(diǎn)。17對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)17個(gè)，多態(tài)性百分含量100%；17對(duì)SSR標(biāo)記有效等位基因數(shù)(ne)介于1.417與3.805之間，平均2.347；觀測(cè)等位基因數(shù)(na)介于2與5之間；Shannon(l)指數(shù)變異范圍為0.566～1.360，平均0.912；基因流(Nm)介于0.030 與1.098之間，平均0.255。表明普通菜豆種質(zhì)資源間變異范圍較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，具有豐富的遺傳多樣性。

2.3 69份普通菜豆種質(zhì)資源的聚類分析

2.3.1 普通菜豆種質(zhì)資源的GS聚類分析 GS聚類結(jié)果顯示(圖2) 69份菜豆種質(zhì)材料間存在著不同程度的遺傳差異性。材料間遺傳相似性系數(shù)(GS)變異范圍為0.392～0.963，平均值為0.659；其中編號(hào)5的秋豆角和編號(hào)60的農(nóng)家品種Y96間遺產(chǎn)相似性系數(shù)最大為0.963，說(shuō)明兩份材料間親緣關(guān)系最近；其次編號(hào)為11和28的材料CX50、紅茬蕓豆及編號(hào)為16和18的材料DQ01和白花蕓豆間關(guān)系相對(duì)較近，遺傳相似性系數(shù)為0.960，說(shuō)明以上材料在菜豆雜交育種中應(yīng)盡量避免作為親本選配組合。其中編號(hào)4的墾蕓3號(hào)和編號(hào)43的GHR1302間遺傳相似性系數(shù)最小為0.392，說(shuō)明這些材料間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；其次編號(hào)8的黑蕓豆Y120和編號(hào)45的紅花臉間的遺傳相似性系數(shù)為0.393，兩者親緣關(guān)系也相對(duì)較遠(yuǎn)；以上這些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的材料可用作親本選配雜交組合材料。以69份菜豆核心種質(zhì)材料間的遺傳相似性系數(shù)按UPGMA法進(jìn)行聚類分析(圖2)。SSR標(biāo)記能很好地區(qū)分69份菜豆種質(zhì)材料，在遺傳相似系數(shù)0.60水平上將69份菜豆種子材料分為兩個(gè)組群：第一組群包含編號(hào)為1、7、19等27份菜豆；在遺傳相似系數(shù)0.67水平上分為I、II兩個(gè)亞組群：第I亞組群包括編號(hào)為19、26、53的Y10Y14、花臉豆和腳?。坏贗I亞組群包含編號(hào)為1的紅腰飯豆等24份菜豆材料。第二組群包含編號(hào)為2、3、6等在內(nèi)的42份材料；在遺傳相似性系數(shù)0.67水平上又分為I、II兩亞組群；第I亞組群包括編號(hào)43、52的GHR1302、蒙古圓兩份材料；第II亞組群包含編號(hào)為40、68、64的翻眼蕓豆、小紅蕓豆、白菜豆等40份菜豆材料，表明普通菜豆種質(zhì)遺傳多樣性豐富。

從左至右依次為1～69號(hào)材料

Figure 1 DNA amplification results of 69 common kidney bean materials by primers BM170

表2 基于SSR標(biāo)記的69份菜豆種質(zhì)材料遺傳多樣性分析

圖2 根據(jù)SSR構(gòu)建的69份普通菜豆種質(zhì)的聚類分析

2.3.2 SSR標(biāo)記主坐標(biāo)聚類分析 通過(guò)主坐標(biāo)分析法對(duì)獲取的69份材料SSR標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，可將69份菜豆分為兩大類，此分類同GS聚類中的聚類結(jié)果基本一致，見(jiàn)圖3。

3 結(jié)論

試驗(yàn)利用篩選17對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)69份普通菜豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，經(jīng)多態(tài)性分析結(jié)果顯示：17對(duì)SSR的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和平均等位變異位點(diǎn)分別為17.00，3.24個(gè)，多態(tài)性百分含量100%；有效等位基因數(shù)(ne)、觀測(cè)等位基因數(shù)(na)和Shannon(l)指數(shù)的平均值分別為2.347，0.912，0.255，表明引物具有較高的多態(tài)性，可用于普通菜豆品種的區(qū)分；69份菜豆種質(zhì)材料間遺傳相似性系數(shù)(GS)變異范圍為0.392～0.963，平均值為0.659，在遺傳相似系數(shù)0.60水平上將69份菜豆種子材料分為兩大組群，在遺傳相似系數(shù)0.67處兩個(gè)組群還共分為4個(gè)亞組群，表明普通菜豆種質(zhì)遺傳多樣性豐富。后續(xù)將進(jìn)行構(gòu)建普通菜豆品種分子身份證，從而利用普通菜豆分子身份證構(gòu)建和遺傳多樣性分析為優(yōu)質(zhì)親本選配、品種鑒定和菜豆品質(zhì)的監(jiān)督與管理提供幫助。

圖3 SSR主坐標(biāo)分析聚類圖