缺氧誘導(dǎo)因子和Notch信號通路在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)疾病間的作用機制

王 萍，李鐵剛

0 引言

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是一種生物過程，其中上皮細(xì)胞失去頂端-基底極性的特征和標(biāo)記，同時獲得高遷移和侵襲能力的間充質(zhì)細(xì)胞的特征[1]。近年來，EMT的研究熱點是組織器官發(fā)生實質(zhì)性癌變起始過程。缺氧是許多實體癌組織細(xì)胞微環(huán)境的主要改變，在缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)通過結(jié)合缺氧反應(yīng)元件激活下游眾多靶基因，從而參與腫瘤能量代謝、血管生成、多藥耐藥以及侵襲轉(zhuǎn)移等多個環(huán)節(jié)，通過Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)EMT，從而控制腫瘤侵襲和纖維化疾病等關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]。

1 缺氧誘導(dǎo)因子

HIF是依賴于氧氣的關(guān)鍵介質(zhì)。缺氧通過氧化還原作用和通過HIF的穩(wěn)定化影響細(xì)胞生長的許多方面。異二聚體HIF轉(zhuǎn)錄因子家族由氧不穩(wěn)定的α組成[3]，亞基(HIF1-3α)和氧穩(wěn)定β亞基[HIF1-3β，或芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白1-3(ARNT1-3)]均含有堿性螺旋環(huán)(bHLH)和PER-ARNT-SIM(PAS)。

在細(xì)胞缺氧反應(yīng)中,HIFα和HIF1β亞基不斷轉(zhuǎn)錄和翻譯，其在蛋白質(zhì)穩(wěn)定性方面有重要作用。由于在氧依賴性降解(ODD)結(jié)構(gòu)域上的特定脯氨酸殘基羥基化，HIFα在常氧期間迅速被降解，通過氧敏感的脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域(PHD)蛋白[4]，羥基化的脯氨酸被泛素連接酶(VHL)識別，導(dǎo)致泛素化和隨后的α亞基蛋白酶體降解。然而，在缺氧期間，PHD蛋白被滅活，導(dǎo)致α亞基的穩(wěn)定化和積累，備用的HIFα與細(xì)胞核中的HIFβ(ARNT)相互作用以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[5]。

HIF-1α和HIF-2α在結(jié)構(gòu)上相似，但在功能上有所不同。HIF-1α可調(diào)節(jié)不同的下游基因組，包括促紅細(xì)胞生成素和糖酵解基因。HIF-2α誘導(dǎo)c-myc、TGF-α、賴氨酰氧化酶[6]、Oct4、Cyclin D1等[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)了新的HIF-1激活調(diào)節(jié)的步驟，可以靶向開發(fā)針對HIF-1相關(guān)疾病(如癌癥)的治療策略[8]。最近的泛基因組研究已經(jīng)確定了數(shù)百個HIF轉(zhuǎn)錄直接靶點，其產(chǎn)物在細(xì)胞過程中發(fā)揮作用，包括LncRNA[9-10]和micRNA[11]。HIF-1調(diào)節(jié)一組microRNA，而部分microRNA可以靶向調(diào)控HIF-1α。microRNA和HIF1之間的相互作用與腫瘤發(fā)生相關(guān)的許多重要事件(如血管生成，代謝，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，增殖，轉(zhuǎn)移和對抗癌療法的抗性)有關(guān)，這可能是未來生物研究的熱點[12]。

Notch可通過募集HIF-1α 上調(diào)LOX，從而穩(wěn)定Snail，促進(jìn)EMT。在百草枯誘導(dǎo)的纖維化模型中，HIF-1α及其下游靶基因LOX表達(dá)顯著增加。PQ處理后E-cadherin表達(dá)降低，α-SMA表達(dá)顯著增加，證實HIF-1α、LOX和EMT與PQ誘導(dǎo)的PF相關(guān)。HIF-1α沉默下調(diào)LOX mRNA和蛋白的表達(dá)。HIF-1α沉默后，EMT標(biāo)志物的表達(dá)也發(fā)生逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞形態(tài)的變化減輕，這表明HIF-1α沉默后PQ誘導(dǎo)的EMT的程度減輕。HIF-1α可通過LOX/β-連環(huán)蛋白途徑調(diào)節(jié)PQ誘導(dǎo)的EMT[13-15]。

MiR210通過靶向調(diào)節(jié)RUNX3直接與HIF-1α和PHD2的C末端激活結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)百草枯誘導(dǎo)的EMT[16]。

2 Notch信號通路

Notch信號傳導(dǎo)是進(jìn)化上保守的細(xì)胞-細(xì)胞通信信號傳導(dǎo)途徑，由一個單通道跨膜受體(Notch1-4)組成，它可以通過與膜栓系配體的相互作用激活，包括Delta樣(Dll)1-4和Jagged(Jag)1-2，其包含跨膜受體Notch和2個跨膜配體[17]Delta和Jagged。當(dāng)Notch與鄰近細(xì)胞的Delta或Jagged結(jié)合時，Notch被切割以釋放進(jìn)入細(xì)胞核的Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(NICD)，激活Notch途徑并調(diào)節(jié)其靶基因[3,18 ]。NICD易位至細(xì)胞核并與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子CSL和輔因子MAML形成三聚體復(fù)合物，以誘導(dǎo)Notch下游基因反應(yīng)。Notch下游基因標(biāo)簽在不同細(xì)胞類型中是多樣的，并且包含Hes和Hey轉(zhuǎn)錄抑制因子的其他效應(yīng)子[19-20]，在特定細(xì)胞譜系的發(fā)展過程中經(jīng)常反復(fù)發(fā)生作用。在沒有NICD的情況下，CSL與各種轉(zhuǎn)錄抑制因子相互作用，然后響應(yīng)于Notch活化而被MAML取代，CSL結(jié)合共抑制劑主要是組蛋白修飾酶的復(fù)合物，使染色質(zhì)保持緊密的無活性狀態(tài);而MAML蛋白募集轉(zhuǎn)錄共激活因子，主要是p300/CBP，具有組蛋白乙?；富钚訹12]。此外，越來越多的證據(jù)表明，啟動子/增強子的NICD-CSL募集誘導(dǎo)動態(tài)組蛋白表觀遺傳修飾，反過來又有利于三聯(lián)復(fù)合物NICD-CSL-MAML或阻遏蛋白結(jié)合的CSL的可及性[21-23]。

Notch介導(dǎo)的生物反應(yīng)涉及多種機制，Notch信號傳導(dǎo)控制器官發(fā)生的各個方面，包括神經(jīng)發(fā)生、血管發(fā)生、肌生成和造血[20]。此外，Notch途徑還涉及細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡的調(diào)節(jié)和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)[24]。

3 Notch與細(xì)胞缺氧反應(yīng)之間的EMT作用

染色質(zhì)免疫沉淀實驗表明，HIF-1α與NICD搭載在Notch反應(yīng)性Hey2啟動子上[27-28]，包括干細(xì)胞的維持[25]。近年研究表明，細(xì)胞缺氧與Notch信號通路有關(guān)[18]，特別是在EMT相關(guān)疾病中。細(xì)胞通過細(xì)胞反應(yīng)適應(yīng)缺氧，其中HIF-1α逐漸穩(wěn)定并直接激活下游基因的轉(zhuǎn)錄。該途徑的某些方面需要與Notch信號傳導(dǎo)整合，即HIF-1α可以與NICD相互作用以增強Notch下游反應(yīng)。研究表明，抑制因子的HIF-1(FIH-1)不僅調(diào)節(jié)HIF活性，還調(diào)節(jié) Notch信號輸出調(diào)節(jié)缺氧反應(yīng)。研究顯示，F(xiàn)IH-1在2個殘基(N1945和N2012)上羥基化NICD，這對于NICD (細(xì)胞內(nèi)的反式激活因子)以及體內(nèi)神經(jīng)發(fā)生和肌細(xì)胞生成期間的功能是關(guān)鍵的。

GSC中HIF-1α和Notch靶基因fabp7 mRNA水平升高。而負(fù)責(zé)HIF-1α基因轉(zhuǎn)錄的STAT3通路、磷脂酰肌醇3-激酶Akt和ERK1/2均參與HIF-1α蛋白的翻譯，在GSC中也被優(yōu)先激活，為HIF-1α作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療靶點提供依據(jù)[29]。FIH-1負(fù)調(diào)節(jié)Notch活性并加速肌原性分化。該研究揭示了Notch受體活化形式翻譯后修飾與Notch和缺氧信號傳導(dǎo)途徑之間錯綜復(fù)雜的交叉偶聯(lián)[30]。此外，研究表明，HIF誘導(dǎo)的Notch信號通路在腫瘤細(xì)胞EMT中起著關(guān)鍵作用[31]。

Notch信號與miRNA之間的聯(lián)系是一個新興的研究領(lǐng)域。二者之間的聯(lián)系可以分為2類：一類是Notch通路中組分的表達(dá)可調(diào)控miRNA，另一類是miRNA調(diào)控Notch的情況。

關(guān)于Notch通路中調(diào)控miRNA的基因的研究較多，如DLL4(Notch配體)可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)miR-27b，首次揭示了miR-27b在血管發(fā)育中可阻止血管過度遷移的特定功能，并將此確定為由血管生成抑制劑和刺激物調(diào)節(jié)的血管生成平衡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。

關(guān)于miRNA調(diào)控Notch的情況，Biyashev等[32-34]研究結(jié)果顯示，miR-30家族表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞高遷移率受Notch信號通路配體DLL4調(diào)控。與HIF一致，除miRNA外，Notch還可控制長非編碼RNA (Long non-coding RNA，lncRNA)。作為T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)中體內(nèi)、體外生長所必需的一組lncRNA，LUNAR1也是受Notch轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的控制，并且維持IGF1信號傳導(dǎo)的能力[35]。最近在大規(guī)模非編碼RNA測序方面的研究進(jìn)展結(jié)果顯示，其中，IL-33-miR-34a-5p-Notch1識別通過成骨細(xì)胞HIF-1α途徑抑制破骨細(xì)胞生成，揭示了HIF-1α途徑在骨重塑影響方面的新的機制[36]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析最初揭示了缺氧后神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中Notch1以及Notch下游基因的上調(diào)[25]，隨后，已顯示缺氧誘導(dǎo)Notch途徑中基因的表達(dá)，并且Notch阻斷消除了許多腫瘤類型中缺氧誘導(dǎo)的分化抑制[3]。HIF增加了乳腺癌細(xì)胞中Notch靶基因如HES1和HEY1的表達(dá)，也增加了Notch受體和配體的表達(dá)，并通過影響EMT通路的表達(dá)來調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的遷移[37]，其機制可能與缺氧使HIF-1α和HIF-2α在細(xì)胞中積累有關(guān)，而缺氧與Notch輔激活劑MAML1協(xié)同增強Notch活性。HIF-1α在缺氧條件下與HES1啟動子結(jié)合。

shRNA下調(diào)HIF-1α可抑制缺氧條件下HES1和HEY1的表達(dá)。HIF增加了Snail的表達(dá)，降低了EMT的標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)。Notch通路抑制消除了缺氧介導(dǎo)Snail表達(dá)的增加，以及乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的減少，可能在EMT和乳腺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生中起重要作用[38]。缺氧導(dǎo)致Jagged2表達(dá)增加，乳腺癌細(xì)胞中EMT[39]，以及乳腺癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞之間的交叉反應(yīng)[39]。Xing等[40]研究表明，由缺氧誘導(dǎo)的Jagged2表達(dá)介導(dǎo)的Notch信號傳導(dǎo)的激活，通過促進(jìn)EMT使Akt活化和細(xì)胞侵襲導(dǎo)致細(xì)胞存活，可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌的新型治療靶點。在一項絨毛膜癌的相關(guān)研究中，HIF-1α明顯上調(diào)，增強且誘導(dǎo)了NICD增加，增強EMT和侵襲能力，伴隨著HIF-1β的升高。同時，在小鼠體外實驗中得到，通過對比對照組，用DAPT(Notch1抑制劑)敲低Notch1表達(dá)有效地抑制了轉(zhuǎn)移性腫瘤生長、代謝和侵襲。結(jié)果表明，HIF-1α的過表達(dá)通過調(diào)節(jié)依賴于Notch信號傳導(dǎo)途徑的EMT來促進(jìn)絨毛膜癌細(xì)胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移[5]。

Notch1的異常表達(dá)在小細(xì)胞肺癌非常普遍[41]，在非小細(xì)胞肺癌中可以觀察到Notch功能獲得性突變[42]。缺氧引起的Notch1上調(diào)使腫瘤細(xì)胞具有顯著的生存優(yōu)勢，并且與異種移植實驗中轉(zhuǎn)移增加有關(guān)[43]。缺氧的微環(huán)境促使腫瘤發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化，包括腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增加、放化療抵抗以及出現(xiàn)一些靶向藥物的耐藥情況等。逆轉(zhuǎn)腫瘤組織內(nèi)的缺氧狀態(tài)是腫瘤治療的一個有前景的研究方向[44]。

4 結(jié)論

Notch信號傳導(dǎo)和細(xì)胞缺氧反應(yīng)之間的交叉反映了細(xì)胞如何應(yīng)對低氧水平非常重要。從治療的角度來看，細(xì)胞缺氧反應(yīng)和Notch信號傳導(dǎo)都涉及一系列病理過程和治療靶點，特別是EMT疾病。