猴頭菇液體菌種中雜菌的分離鑒定及變化規(guī)律

張楠 李鑫 唐宗福

摘要：為掌握猴頭菇液體制種過程中主要感染雜菌的種類及變化規(guī)律，以采取有效的措施降低染菌率，分析猴頭菇活化菌種保存時間與種子液染菌率的關(guān)系，鑒定種子液中感染雜菌的種類和來源，評價6種抗生素對雜菌的抑制作用。結(jié)果表明，猴頭菇活化菌種在溫度為4 ℃條件下，于0～5 d時間段內(nèi)接種于液體培養(yǎng)基時染菌率最低，均在20%左右，隨著時間的延長，染菌率呈上升趨勢。感染種子液的雜菌有5種（分別命名為WR1、WR2、WR3、WR4、WR5），其中4種為芽孢桿菌和1種為葡萄球菌，主要來源于進行試驗場所的空氣中，它們對硫酸慶大霉素和乳酸鏈球菌素較為敏感。綜上所述，要解決猴頭菇液體制種過程中染菌的問題，首先是嚴格規(guī)范試驗操作，其次是減少活化菌種保存時間，最后是保持實驗室空氣清潔。必要時在種子培養(yǎng)基中可以加入一定量的乳酸鏈球菌素，以減少染菌率。

關(guān)鍵詞：猴頭菇;液體菌種;雜菌;分離鑒定;雜菌的來源;最小抑/殺菌濃度;變化規(guī)律

中圖分類號： S646.904 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）17-0157-05

猴頭菇（Hericium erinaceus），因其形狀酷似猴子頭而得名，別稱猴頭菌、猴頭蘑、刺猬菌等，是一種重要的藥食兩用菌[1]。它含有多肽、多糖、酰胺、甾體化合物、萜類化合物、酚類化合物、生物堿類化合物和吡喃酮類化合物等，具有抗腫瘤、抗?jié)儭⒖寡趸?、抗炎癥、抗疲勞、增強免疫力、保護肝脾、降血糖、降血脂等功效[2-3]，對神經(jīng)衰退及老年癡呆等神經(jīng)性疾病有較好的治療效果。這些良好的生理功效正日益受到人們的關(guān)注和重視，許多猴頭菇相關(guān)的食品和保健品得以開發(fā)利用，猴頭菇市場需求不斷擴大，猴頭菇產(chǎn)品的主要生產(chǎn)原料主要來自猴頭菇成熟的子實體和通過發(fā)酵產(chǎn)生的菌絲體[4]，猴頭菇子實體和菌絲體的獲得均需要大量的猴頭菇菌種，菌種生產(chǎn)是首道工序，其直接關(guān)系到猴頭菇產(chǎn)量與品質(zhì)，是生產(chǎn)成敗的關(guān)鍵[5]。

猴頭菇菌種的生產(chǎn)方式主要有2種，一種是傳統(tǒng)的固體菌種，另一種是液體菌種，與固體菌種相比，液體菌種具有很多優(yōu)越性[6]。首先，液體菌種沒有級別之分，既可以作為母種接種到原種培養(yǎng)基中，也可以作為栽培種直接接種到栽培袋中，既簡化了生產(chǎn)工藝，又降低生產(chǎn)成本;其次，液體菌種在完全無菌條件下制得，菌種純度高，菌齡一致;再次，液體菌種萌發(fā)速度快，可降低污染率;最后，液體菌種操作簡便，生產(chǎn)周期短、易于工業(yè)化生產(chǎn)[7-8]。目前，液體菌種的制備多采用“（斜面）母種→一級搖瓶種→二級搖瓶種→培養(yǎng)器”的生產(chǎn)工藝[9-10]，其中由斜面母種制備一級搖瓶種這一環(huán)節(jié)最容易出現(xiàn)感染雜菌的現(xiàn)象，這一環(huán)節(jié)染菌可最終導致培養(yǎng)器染菌。染雜菌的發(fā)生主要是由母種帶菌（感染了雜菌）造成的，食用菌母種在轉(zhuǎn)接或保存過程中最容易感染細菌（這種現(xiàn)象很難用肉眼去發(fā)現(xiàn)），往往造成食用菌的一級搖瓶種和二級搖瓶種染菌，這也是食用菌產(chǎn)業(yè)合作社和食用菌種植戶在栽培過程中不采用液體菌種的主要原因。

前人將染菌預防措施的研究重點放在加強環(huán)境衛(wèi)生管理、選用純度高和菌絲健壯的菌種等方面，并未對液體菌種易感染的雜菌種類、來源及相關(guān)規(guī)律進行探究[7]。因此，本研究分離和鑒定猴頭菇液體菌種易感染的細菌，并分析它們的來源，探討雜菌感染率與活化的斜面母種（從沙土管和液體石蠟保存的菌種）保存時間的變化規(guī)律，還提出了相應的防治措施。目的是為了幫助食用菌專業(yè)合作社或者食用菌種植戶能采取防治液體菌種染菌的措施，預防或減少猴頭菇液體菌種制備過程中染菌的發(fā)生，從而加快猴頭菇液體菌種的應用和推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 猴頭菇TJH-03分離自四川省唐家河國家級自然保護區(qū)的猴頭菇鮮標本。

1.1.2 培養(yǎng)基 猴頭菇菌株活化培養(yǎng)基為改良PDA培養(yǎng)基[11]，猴頭菇液體種子液培養(yǎng)基為改良PDA液體培養(yǎng)基，猴頭菇液體菌種中感染的雜菌分離培養(yǎng)基為LB固體培養(yǎng)基。

1.1.3 抗生素 硫酸慶大霉素（效價≥590 μg/mg）、硫酸卡那霉素〔效價（無水）≥750 μg/mg〕、氨芐青霉素鈉（效價 845～988 μg/mg）和硫酸鏈霉素（效價650～850 μg/mg）均為USP級（美國藥典標準），均購于美國Amresco公司。乳酸鏈球菌素（nisin）為食品級，購于石家莊春信生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的活化 用直徑為10 mm的無菌打孔器在培養(yǎng)好的猴頭菇TJH-03平板上打取長勢一致的菌餅，用滅菌小鑷子挑取打好的菌片接種到PDA平板中央上（培養(yǎng)基體積為15 mL），每皿放1片菌，于溫度為25 ℃條件下倒置培養(yǎng)5～7 d，得到TJH-03活化菌種，用封口膜密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同保存時間對種子液染菌率的影響 將活化的TJH-03菌種保存于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱和4 ℃冰箱中。在保存0、1、5、10、15、20 d同一條件下取8個平板，接種于種子液培養(yǎng)基（50 mL/500 mL三角瓶）中，每瓶取4片菌餅，接種50瓶，在25 ℃溫度條件下120 r/min培養(yǎng)7 d，計算染菌率。每天觀察種子液的狀態(tài)變化，在培養(yǎng)的過程中如果種子液出現(xiàn)渾濁的現(xiàn)象，說明它們感染了雜菌。每組試驗重復3次，數(shù)據(jù)以平均數(shù)表示。

1.2.3 種子液中雜菌的分離與純化 采用稀釋平板涂布法對猴頭菇感染雜菌的種子液中的細菌進行分離[12]，在無菌條件下取10 mL種子液加到裝有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15 min，再以無菌生理鹽水進行10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋，取3個連續(xù)梯度的稀釋液各0.2 mL涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃條件下倒置培養(yǎng)24～36 h待培養(yǎng)皿長出菌落，根據(jù)形態(tài)、顏色等挑選典型菌落在LB固體培養(yǎng)基上劃線純化，重復3～4次，直至出現(xiàn)單菌落，將純化后的單菌株接入LB培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)并保存菌種。

1.2.4 雜菌的分類鑒定 通過形態(tài)、生理生化特性并結(jié)合16S rRNA基因序列對種子液中感染的雜菌進行分類鑒定。形態(tài)特征采用革蘭氏染色觀察法，生理生化鑒定參照東秀珠等《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》上的方法[13]進行測定。

16S rDNA鑒定：用TaKaRa miniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒提取菌株DNA，具體步驟參見試劑說明書，用27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）引物擴增16S rDNA，所用試劑為TaKaRa PCR Amplification Kit，PCR步驟和程序采用吳曉暉等的方法[14]。PCR擴增產(chǎn)物送于生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因序列測定。將基因序列在NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)中進行序列同源性分析，并使用MEGA 6.0軟件對基因序列進行系統(tǒng)發(fā)育分析和進化樹的構(gòu)建。

1.2.5 雜菌的來源分析 參照GB/T 16294—2010《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》[15]對進行猴頭菇液體菌種相關(guān)試驗場所（主要包括接種室、超凈工作臺、培養(yǎng)室、保存室、冰箱）環(huán)境中的微生物進行收集，采樣結(jié)束后于TSA平板32 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d[16]。根據(jù)形態(tài)、顏色等挑選平板中典型菌落，劃線純化，通過形態(tài)、生理生化特性并結(jié)合16S rRNA基因序列進行分類鑒定，并與WR1、WR2、WR3、WR4、WR5進行同源性分析。

1.2.6 最小抑/殺菌濃度的測定 取無菌96微孔板，第1孔加入150 μL的MH肉湯培養(yǎng)基（不含抗生素）作為陰性對照，第2孔至第11孔分別加入75 μL的MH肉湯培養(yǎng)基2倍稀釋各抗生素溶液，使各孔最終質(zhì)量濃度分別為2 000.00、1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.95 μg/mL[17-18]。第2孔至第12孔分別加入1×106 CFU/mL 細菌懸液75 μL，第12孔再加入75 μL的MH肉湯培養(yǎng)基作為陽性對照，將微孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24 h，觀察各孔的變化。最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，簡稱MIC）和最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，簡稱MBC）測定參照美國臨床試驗標準委員會（clinical and laboratory standards institute，簡稱NCCLS）的第25版信息增刊M100-S25文件[19]。以菌株WR1、WR2、WR3、WR4和WR5為指試菌，測定硫酸慶大霉素、卡那霉素、氨芐青霉素、乳酸鏈球菌素和硫酸鏈霉素對它們的MIC和MBC。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 所有試驗重復3次，檢測數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，用SAS 9.4軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同保存溫度及時間對種子液染菌率的影響

由表1可知，在4 ℃條件下冷藏和在20 ℃恒溫條件下，染菌率的變化趨勢較為一致，均隨著保存時間的延長，染菌率逐漸上升，4 ℃溫度條件下染菌率從16.00%升到45.33%;在20 ℃溫度條件下，染菌率從18.00%升到46.00%。在1～5 d的時間段出現(xiàn)了平穩(wěn)區(qū)域，染菌率差異不顯著（P>0.05），均在20%左右;而在5～15 d時染菌率顯著上升，5、10、15 d染菌率的差異極顯著。

2.2 種子液中雜菌的分離與鑒定

從感染細菌種子液中共分離純化得到5種菌株，分別記為WR1、WR2、WR3、WR4、WR5。隨著菌種保存時間的延長，在接種時不但導致染菌率的增加，同時還導致感染細菌種類的增加（表2）。菌種在保存0、1 d接種時，從感染的種子液中分離純化得到2種菌株，即WR1、WR2;在保存 5 d 時，WR1、WR2、WR5被分離純化得到;在保存10 d時，分離純化得到菌株在WR1、WR2、WR5的基礎(chǔ)上增加了WR4;在保存15、20 d時，5種菌株全部被分離純化得到。

參考《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13，20]，結(jié)合表2、表3的試驗結(jié)果，初步確定菌株WR1、WR2、WR4、WR5分別與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis）、阿耶波多氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）、貝萊斯芽孢桿菌（B. aryabhattai）鑒定特征接近，菌株WR3與Staphylococcus petrasii鑒定特征相接近[21-22]。

將5株細菌16S rRNA序列通過BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進行同源性比對分析，選取同源性較高的模式菌株，通過MEGA 6.06軟件采用Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1、圖2），并用DNAMAN 8.0軟件計算序列的相似性。結(jié)果表明，菌株WR1與蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579（NR_074540.1）高度相近，相似性高達99.86%;菌株WR2與枯草芽孢桿菌JCM 1465（NR_113265.1）相似性高達100.00%;菌株WR3與S. petrasii CCM 8418（NR_118450.1）高度相近，相似性高達100.00%;菌株WR4與阿耶波多氏芽孢桿菌B8W22（NR_115953.1）高度相近，相似性高達99.65%;菌株WR5與貝萊斯芽孢桿菌FZB42（NR_075005.2）高度相近，相似性高達99.86%。結(jié)合形態(tài)特征及生理生化鑒定結(jié)果，最終將菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5分別鑒定為蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、S. petrasii、阿耶波多氏芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌。

2.3 雜菌的來源分析

將WR1、WR2、WR3、WR4、WR5與相關(guān)試驗場所內(nèi)的微生物進行對比，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，WR1、WR2、WR4和WR5均存在于接種室、 培養(yǎng)室、保存室和冰箱中，說明猴頭菇液體菌種在制備過程中污染的雜菌主要來自于進行試驗的場所內(nèi)。從雜菌來源來看，嚴格規(guī)范試驗操作是減少污染最主要的途徑，減少實驗室的內(nèi)空氣流動也十分必要[23]。此外，WR3還未找到來源，須進一步研究。

2.4 最小抑/殺菌濃度的測定

由表5可知，硫酸慶大霉素和乳酸鏈球菌對菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5均具有較好抑菌效果，硫酸慶大霉素對菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MIC分別為31-25、31.25、62.50、31.25、31.25 μg/mL，乳酸鏈球菌對菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MIC分別為250.00、500-00、125-00、125.00、500.00 μg/mL。取MIC以上無細菌生長的清亮管中100 μL培養(yǎng)液涂布肉湯固體培養(yǎng)基平板上，進行活菌計數(shù)，37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)12 h，觀察有無細菌生長。平板上細菌計數(shù)少于5個菌落者的最低濃度為MBC。因此，確定硫酸慶大霉素對菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MBC分別為250.00、125.00、500.00、500.00、125.00 μg/mL，乳酸鏈球菌素對菌株WR1、WR2、WR3、WR4、WR5的MBC分別為1 000.00、1 000.00、500.00、250.00、1 000.00 μg/mL。

3 結(jié)論與討論

食用菌液體菌種是指采用液體深層培養(yǎng)法獲得的菌種[24]，是在發(fā)酵罐中采用液體培養(yǎng)基通入無菌空氣并加以攪拌，以增加培養(yǎng)基中的溶氧量，控制發(fā)酵工藝參數(shù)，給菌絲生長提供一個最佳的營養(yǎng)、酸堿度、溫度、供氧量，使菌絲快速生長，迅速擴繁，在短時間內(nèi)獲得大量菌種。液體菌種在香菇[9]、草菇[25]、雙孢蘑菇[26]、杏鮑菇[27]、金針菇[28]的生產(chǎn)和栽培上得到應用，并表現(xiàn)出制種周期短、接種效率高、定植封面快、發(fā)菌周期短、菌齡一致以及污染率和生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，適合食用菌規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)。

食用菌液體制種技術(shù)不同于傳統(tǒng)的固體制種技術(shù)，生產(chǎn)環(huán)節(jié)較多，易引起雜菌感染菌種，使食用菌商品率降低，經(jīng)濟效益下降。研究發(fā)現(xiàn)，造成猴頭菇液體菌種污染的主要原因是專用母種帶菌，即專用種在制作過程中造成污染或者是在存貯過程中造成二次污染，這就要求活化好的猴頭菇菌種應在0～1 d內(nèi)進行液體培養(yǎng)基接種，最長不超過5 d，不僅可以降低染菌概率，還可以保持菌種良好活性。從感染雜菌的種類看，主要是芽孢桿菌（WR1、WR2、WR4、WR5）和葡萄球菌（WR3），其中WR1和WR2為主要感染菌。此外，WR1、WR2、WR4和WR5主要存在于微生物接種室、培養(yǎng)室、保存室和冰箱中，說明猴頭菇液體菌種染菌可能是研究人員在微生物研究過程中操作不當引起的污染。因此，液體菌種栽培對操作人員要求更高，生產(chǎn)中要嚴格實行操作技術(shù)規(guī)程，具有較強的無菌意識，同時要對菌種制備室進行定期有效的消毒，消除雜菌。

最小抑/殺菌濃度的測定結(jié)果顯示，硫酸慶大霉素和乳酸鏈球菌素對菌株WR1、WR2、WR3、WR4和WR5的抑菌效果佳，因此，在試驗允許的前提下可以在培養(yǎng)基中加一定量的抗生素，可優(yōu)先選擇乳酸鏈球菌素。乳酸鏈球菌素是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種新型多肽，對許多革蘭氏陽性菌具有強烈的抑制作用，攝入后可被人體中的蛋白酶降解為各種氨基酸，沒有毒副作用，因此它是目前世界上唯一允許使用在食品防腐方面的抗菌素[18，29]。乳酸鏈球菌素耐酸、耐熱性能優(yōu)良，在酸性條件下高溫滅菌時仍呈現(xiàn)穩(wěn)定性[30]，而猴頭菇菌絲適宜在酸性環(huán)境下生長，一般要求pH值在4.5～6.5[31]，這樣就可以在液體種子培養(yǎng)基中加入乳酸鏈球菌素，與培養(yǎng)基一起高溫滅菌，冷卻到適宜的溫度后，接入菌種即可。這也為猴頭菇菌液體深層發(fā)酵和猴頭菇菌絲體的應用提供了技術(shù)支持，用液體發(fā)酵法生產(chǎn)的猴頭菇菌絲體要比栽培生產(chǎn)子實體簡便、快速，并且通過發(fā)酵生產(chǎn)的猴頭菇菌絲體的營養(yǎng)成分無論是蛋白質(zhì)、氨基酸含量還是維生素含量均類似于子實體，用液體發(fā)酵菌絲體可以制備食用菌飲料、調(diào)味品、食品添加劑及飼料添加劑等[32]，開發(fā)利用猴頭菇液體發(fā)酵獲得菌絲體及其代謝產(chǎn)物來制備藥物具有較好的發(fā)展前景。

本研究表明，在猴頭菇液體菌種制備過程中，活化菌種應在0 d內(nèi)進行接種，最長不要超過5 d，既能保持菌種的活性，又能降低染菌率。感染液體菌種的主要雜菌是蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis），其次是S. petrasii、阿耶波多氏芽孢桿菌（B. aryabhattai）和貝萊斯芽孢桿菌（B. aryabhattai）。防治猴頭菇液體菌種污染的有效措施是嚴格規(guī)范試驗操作、減少菌種保存時間和保持實驗室空氣清潔。乳酸鏈球菌素作為唯一被允許用作食品添加劑的細菌素，不僅能夠減少猴頭菇液體菌種和菌絲體發(fā)酵的染菌率，還能夠滿足食品安全要求。

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