長鏈非編碼RNA BDNF-AS在乳腺癌中的表達(dá)及作用

吳多明 武力 張曉斌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，病死率位居第4 位，并呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。目前，治療乳腺癌的手段主要包括手術(shù)、化療和放療，但很多機制仍未闡明。近年來，基因治療發(fā)展成為診療腫瘤的研究熱點，探尋與乳腺癌相關(guān)的抑癌基因和促癌基因為乳腺癌的診治提供了新的研究方向［1］。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA。研究報道，多種lncRNA在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［2］。lncRNA 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）-AS是BDNF的天然反義轉(zhuǎn)錄物。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中47個lncRNA表達(dá)具有顯著性差異，其中l(wèi)ncRNA BDNF-AS表達(dá)顯著下調(diào)［3］。BDNF與乳腺癌發(fā)病、預(yù)后和耐藥等密切相關(guān)［4］，因此，探討lncRNA BDNF-AS在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義。本研究旨在通過檢測乳腺癌患者的癌組織與癌旁正常組織中的BDNF-AS表達(dá)差異，探討B(tài)DNFAS對乳腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集 隨機選取2016年1月至2018年12月88例于蘭州大學(xué)第一醫(yī)院行乳腺癌手術(shù)切除患者的組織標(biāo)本，均經(jīng)病理學(xué)確診，術(shù)前未行放、化療等任何治療，標(biāo)本中的癌旁組織距癌組織5 cm 左右。本研究由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞和試劑 正常人乳腺細(xì)胞系HBL-100和人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3購于美國模式培養(yǎng)物保藏所細(xì)胞庫。培養(yǎng)基和胎牛血清購于美國BI公司。Trizol、RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑購于山東寶生物工程有限公司。lncRNA BDNF-AS、BDNF 和β-actin 引物、pcD?NA3.1、pcDNA3.1-BDNF-AS 和LipofectamineTM2000由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計合成和提供。MTT、Caspase-3 活性檢測試劑盒購于江蘇碧云天生物技術(shù)公司。一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin和BDNF）和羊抗鼠二抗購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌細(xì)胞系（MDA-MB-231、MDA-MB-468和SK-BR-3）及正常乳腺細(xì)胞HBL-100使用10%胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-7細(xì)胞使用10%胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，均在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合至60%～70%，使用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000 包載pcDNA3.1-BDNF-AS 轉(zhuǎn)染至MDA-MB-231 細(xì)胞內(nèi)。通過RT-qPCR檢測BDNF-AS表達(dá)，評價其轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 MTT 法檢測 細(xì)胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至所需時間（0、12、24和48 h）后，加入MTT 溶液反應(yīng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，加入DMSO 溶解，490 nm波長下檢測OD 值，反映細(xì)胞活性。

1.2.4 比色法檢測Caspase-3 活性 提取細(xì)胞裂解液中總蛋白，并測定濃度。參照試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，37℃孵育2 h，405 nm波長下檢測OD值。

1.2.5 EdU 檢測細(xì)胞增殖能力 細(xì)胞培養(yǎng)板中加入EdU 滲入工作液，繼續(xù)培養(yǎng)3 h 后，經(jīng)4%多聚甲醛固定，加入0.5%TritonX-100 打孔，再加入染色液孵育30 min，DAPI染核。于熒光顯微鏡下拍照，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為EdU 陽性細(xì)胞即新增殖的細(xì)胞，計算EdU 陽性率，反映細(xì)胞增殖能力。EdU 陽性率=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI染色的總細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 RT-qPCR 檢測lncRNA BDNF-AS表達(dá)組織或細(xì)胞經(jīng)Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用ABI-7300PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增和檢測，并分析計算其表達(dá)量。引物序列如下：BDNF-AS 上游為5'-AGCC ATGTGACTGATCTTCG-3'，下游為5'-GGAGCCAAC AAACAACTGGT-3'；BDNF 上游為5'-AAACATCCG AGGACAAGGTG-3'，下游為5'-AGAAGAGGAGGCT CAAAGG-3'；β-actin 上游為5'-CATGTACGTTGCTA TCCAGGC-3'，下游為5'-CTCCTTAATGTCACGCAC GAT-3'。

1.2.7 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 刮取培養(yǎng)板中細(xì)胞，3 000 rpm/min，離心60 min后收集蛋白裂解液，吸取上清，加入上樣緩沖液，99℃變性，蛋白濃度由BCA蛋白測定試劑盒測定，并計算20 μg總蛋白對應(yīng)的上樣體積。將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，在4℃下使用一抗（Bax、Bcl-2、MMP-9、E-cadherin 和BDNF）孵育過夜，TBST漂洗，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗，顯影。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實驗 將MDA-MB-231細(xì)胞接種在6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)100%時，使用移液器頭垂直劃出3個間隔，置于含不同干預(yù)因素的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。于0、24和48 h分別拍照，比較劃痕寬度。

1.2.9 Transwell細(xì)胞侵襲實驗 將MDA-MB-231細(xì)胞接種于未涂Matrigel的Transwell小室，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棉簽擦凈未遷移的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)每一視野內(nèi)穿過膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析one-way ANOVA 比較多組間差異，采用t檢驗比較兩組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌患者癌組織和乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

88 例乳腺癌患者的癌旁組織較癌組織中l(wèi)n?cRNA BDNF-AS 表達(dá)下調(diào)（圖1A），與正常的乳腺細(xì)胞相比lncRNA BDNF-AS 在乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其中在MDA-MB-231 細(xì)胞中下調(diào)最顯著（圖1B）。因此，后續(xù)lncRNA BDNF-AS 過表達(dá)的細(xì)胞功能檢測選擇在MDA-MB-231細(xì)胞完成。

圖1 乳腺癌組織和細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA BDNF-AS的表達(dá)

2.2 乳腺癌患者組織中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

以乳腺癌患者lncRNA BDNF-AS 的平均表達(dá)水平為cut-off 值，分為低表達(dá)43 例和高表達(dá)45 例。BDNF-AS 的表達(dá)與TNM 分期（P＜0.05）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P＜0.05）呈負(fù)相關(guān)，但與年齡、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（HER-2）無關(guān)（P＞0.05，表1）。

2.3 過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

與空白質(zhì)粒pcDNA3.1比較質(zhì)粒pcDNA3.1-BDNFAS可過表達(dá)lncRNA BDNF-AS（圖2A），過表達(dá)lncRNA BDNF-AS可降低MDA-MB-231細(xì)胞活性（圖2B），且減少EdU 陽性細(xì)胞數(shù)（圖2C、D），表明過表達(dá)lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖。

2.4 過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細(xì)胞凋亡影響

過表達(dá)lncRNA BDNF-AS可顯著增加Caspase-3的活性（圖3A），并下調(diào)Bcl-2蛋白和上調(diào)Bax蛋白表達(dá)（圖3B、C），表明過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。

表1 88例乳腺癌患者組織中l(wèi)ncRNA BDNF-AS表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系

2.5 過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

細(xì)胞劃痕實驗表明過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 可抑制乳腺癌細(xì)胞遷移（圖4A），Transwell 實驗結(jié)果表明過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 可抑制細(xì)胞侵襲（圖4B），pcDNA3.1-BDNF-AS 可下調(diào)MMP-9 蛋白和上調(diào)E-cadherin 蛋白表達(dá)（圖4C），進(jìn)一步證實過表達(dá)lncRNA BDNF-AS抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

2.6 過表達(dá)lncRNA BDNF-AS對BDNF表達(dá)的影響

過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞中的BDNF mRNA 和蛋白的表達(dá)（圖5），表明ln?cRNA BDNF-AS負(fù)性調(diào)控BDNF表達(dá)。

圖2 質(zhì)粒pcDNA3.1-BDNF-AS對lncRNA BDNF-AS表達(dá)和乳腺癌細(xì)胞增殖的影響

圖3 質(zhì)粒pcDNA3.1-BDNF-AS對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

圖4 質(zhì)粒pcDNA3.1-BDNF-AS對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響

圖5 質(zhì)粒pcDNA3.1-BDNF-AS對BDNF表達(dá)的影響

3 討論

近年來，lncRNAs 在乳腺癌中的作用逐步被揭示［5-6］，如乳腺癌組織中的lncRNA HOTAIR 表達(dá)上調(diào)與乳腺癌的分化程度和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，lncRNA HO?TAIR可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞侵襲［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA GASL1表達(dá)水平下調(diào)，lncRNA GASL1抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡［8］。此外，本課題組還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA AFAP1 AS1 表達(dá)上調(diào)與腫瘤惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)［9］。

有研究報道，在結(jié)腸癌、宮頸癌和食道癌癌組織中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 表達(dá)下調(diào)，參與癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［10-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，相比乳腺癌患者癌旁組織，癌組織中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 表達(dá)顯著下調(diào)，進(jìn)一步分析lncRNA BDNF-AS 表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，癌組織中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，提示lncRNA BDNF-AS 可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。此外，在乳腺癌細(xì)胞株和正常乳腺細(xì)胞中，本研究檢測lncRNA BDNF-AS的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 表達(dá)顯著低于正常乳腺細(xì)胞。為確證lncRNA BDNF-AS在乳腺癌中的作用，進(jìn)一步探討lncRNA BDNF-AS 對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA BDNF-AS可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)凋亡，表明lncRNA BDNF-AS對乳腺癌具有抑癌作用。

lncRNA BDNF-AS 屬于反義lncRNA。反義ln?cRNA 是一類從蛋白或非蛋白編碼基因的相反鏈上轉(zhuǎn)錄而來的lncRNA，常與編碼蛋白的基因完全或部分互補。研究表明，反義lncRNA 可能通過特殊的二級結(jié)構(gòu)以及抑制翻譯過程等作用機制負(fù)向調(diào)控正義基因的表達(dá)［13-14］。lncRNA BDNF-AS 的正向基因為BDNF，在乳腺癌組織中BDNF高表達(dá)，并與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復(fù)發(fā)、生存期短和預(yù)后不良相關(guān)［9］。因此，本研究進(jìn)一步觀察乳腺癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BDNF-AS 對BDNF 的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)lncRNA BDNF-AS 可抑制BDNF 表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中BDNF-AS通過下調(diào)BDNF抑制細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期［15］?；谏鲜鲅芯?，本研究推測lncRNA BDNF-AS 可能通過依賴于BDNF的下游信號分子負(fù)性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA BDNF-AS表達(dá)與乳腺癌惡性程度和轉(zhuǎn)移相關(guān)，其在乳腺癌組織和乳腺癌細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào)。lncRNA BDNF-AS 促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并抑制凋亡，其機制與上調(diào)BDNF 表達(dá)相關(guān)。lncRNA BDNF-AS 可能會成為乳腺癌診斷的新型生物標(biāo)志物和防治乳腺癌的新靶點。