核糖核酸恒溫擴增技術(shù)在兒童肺炎支原體感染診斷中的應(yīng)用

官雁鳴 許洪琴 俞穎*

肺炎支原體(mycoplasma pneumoniae,MP)是一種常見的呼吸道致病菌[1].近年來,環(huán)境污染,抗生素耐藥等因素導致兒童呼吸道疾病頻發(fā),其中肺炎支原體的感染率也呈逐年上升的趨勢[2].兒童感染MP后,早期快速的病原學檢測對指導疾病的治療顯得至關(guān)重要.核糖核酸恒溫擴增法(SAT-RNA)是一種新興的檢測"活菌"的技術(shù).不僅具有較高的特異性和敏感度,還可對病原體進行快速檢測.目前,SAT-RNA技術(shù)已經(jīng)在結(jié)核分枝桿菌等病原體檢測中體現(xiàn)了較高的診斷價值[3-4].近年來SAT技術(shù)在經(jīng)過逐漸完善后也逐漸應(yīng)用于MP檢測,但對其臨床應(yīng)用價值,尚不可知.本資料通過采用回顧病例,分析SAT技術(shù)在兒童MP感染的早期實驗室診斷,從而為臨床用藥提供新的輔助工具.

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年7月至2018年5月因呼吸道疾病在本院入院治療的患兒593例.其中男333例,女260例;年齡1個月至15歲.其中0~12個月(嬰兒期)67例、1~3歲(幼兒期)210例、4~6歲(學齡前期)194例、7~15歲(學齡期)122例;支氣管肺炎16例,急性扁桃體炎25例,上呼吸道感染44例,支氣管炎89例,肺炎419例;短病程(≤7d)225例和長病程(>7d)368例.

1.2 診斷標準 根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、體格檢查及輔助檢查等結(jié)果并參照《中華人民共和國傳染病防治法》中呼吸道感染的診斷標準[5].

1.3 檢測方法 MP核糖核酸檢測試劑盒于上海仁度生物科技有限公司購買.在住院當天采集患兒咽拭子,向咽拭子棉簽中加入約1ml生理鹽水,震蕩咽拭子管,待咽拭子棉簽上的分泌物溶入生理鹽水中以后,加入等量裂解液制成待測樣本.在待測樣本中加入內(nèi)標,用磁珠法提取目標RNA,根據(jù)實驗需要配置一定量的擴增檢測液,并轉(zhuǎn)至實時熒光定量PCR儀進行擴增,其中FAM為樣本通道,HEX為內(nèi)標通道.以42℃1min為1個循環(huán),共擴增40個循環(huán).設(shè)定閾值后分別讀取每個樣本的dt值.

1.4 結(jié)果判讀 dt≥40為陰性,dt≤35為陽性;35≤dt≤40,則樣本重新進行擴增,設(shè)定dt≤35為陽性,dt>35為陰性.

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件.率和構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結(jié)果

2.1 肺炎支原體RNA的總體檢出情況 593例咽拭子標本中檢出65例陽性,總陽性檢出率為10.96%.

2.2 肺炎支原體RNA在不同呼吸道疾病中的檢出情況 見表1.

表1 肺炎支原體RNA在不同呼吸道疾病中的檢出情況(n)

2.3 肺炎支原體RNA各年齡組中的檢出情況 見表2.

表2 各年齡組患兒肺炎支原體RNA檢出情況(n)

2.4 不同季節(jié)肺炎支原體RNA檢出情況 見表3.

表3 不同季節(jié)肺炎支原體RNA檢出情況(n)

2.5 不同住院時間肺炎支原體RNA檢出率 見表4.

表4 不同住院時間肺炎支原體RNA檢出率(n)

3 討論

MP是一種特殊的微生物,其大小介于病毒和細菌之間,主要通過飛沫途徑傳播,侵犯人體呼吸系統(tǒng)[6],可致肺炎、急性支氣管炎等疾病[7].MP感染缺乏特異性的臨床表現(xiàn),基本與病毒感冒類似,易被誤診而延誤治療.可見,準確而又快速的檢測,對于臨床診斷及治療意義重大.

目前臨床實驗室中主流的MP檢測方法包括以培養(yǎng)技術(shù)為主的傳統(tǒng)MP培養(yǎng)法、MP快速培養(yǎng)法,還有以血清學為主的血清IgM抗體檢測技術(shù)以及以分子生物法為主的PCR技術(shù).傳統(tǒng)的MP培養(yǎng)法雖然是金標準,但由于其培養(yǎng)條件嚴苛,檢測耗時較長,故難以應(yīng)用于MP的早期診斷.快速培養(yǎng)法根據(jù)液體培養(yǎng)基的顏色變化來判斷結(jié)果,但易受非特異性菌干擾,所以特異性不高.血清學抗體檢測操作簡便,但是存在窗口期的問題.一般兒童感染肺炎支原體約1周后,血清中才能檢測出MP-IgM抗體,12周后才開始逐漸消失,且存在年齡等因素的個體差異,因此早期診斷價值不高;PCR技術(shù)主要檢測患者局部感染灶分泌物中的DNA,具有較好的敏感度和特異性,是目前應(yīng)用于早期診斷的較好的方法,但MP -DNA持續(xù)攜帶中位數(shù)時間為7周,個別甚至長達7個月[8],所以無法區(qū)分正在感染還是攜帶狀態(tài).RNA-SAT作為新一代活菌檢測技術(shù),能解決上述檢測方法的問題.因為RNA僅存在于活菌中,因此陽性提示正在感染,從而和既往感染區(qū)分開.此外還能縮短窗口期,避免假陽性.另外SAT是一種無創(chuàng)檢查方法,兒童的依從性更好.

本資料發(fā)現(xiàn),呼吸道疾病患兒MP的總陽性率約為10.96%.在MP所致疾病中,陽性檢出率最高的是肺炎,隨后依次為為支氣管肺炎、急性上呼吸道感染等.一旦發(fā)生呼吸疾病,應(yīng)及時進行病原學檢測,以達到早期檢測,合理用藥的目的.在不同年齡組中,學齡前和學齡兒童的檢出率較高,其主要原因在于MP感染主要見于>5歲的兒童,而在<5歲兒童中感染率相對較低,提示要在學齡前和學齡期兒童中做好預(yù)防保健工作.此外,低年齡組患兒取樣不成功也可能是檢出率低的原因.在對不同季節(jié)MP檢出率的統(tǒng)計中,作者發(fā)現(xiàn)秋冬季是MP檢出的高峰期,提示秋冬季是MP的好發(fā)季節(jié).在對患兒住院病程的分析中,發(fā)現(xiàn)短病程組中MP的檢出率要比長病程高,這是因為SAT技術(shù)檢測的靶標是只存在于活菌體內(nèi)的RNA,當病程較長時,RNA的活性可能會因為用藥情況、自身免疫等因素而下降,因此MP-SAT診斷MP感染時應(yīng)注意取樣時間.

綜上所述,MP-SAT技術(shù)能縮短MP檢測窗口期,可區(qū)分"正在感染"和"病菌攜帶",在兒童MP的早期診斷中有較高價值.MP感染主要發(fā)生在秋冬季節(jié),學齡前兒童和學齡兒童是易感人群.臨床醫(yī)生在懷疑MP感染時,應(yīng)及早采集咽拭子送檢.