蛻皮甾酮對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖及分化的影響

湯樣華 羅淦 熊振飛 岳振雙 辛大偉 曾林如*

糖皮質(zhì)激素臨床應(yīng)用廣泛,如器官移植、惡性腫瘤、炎癥和自身免疫性疾病等多種疾病的治療.但是長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療卻可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[1-3].因糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的較為常見(jiàn)的致病因素.糖皮質(zhì)激素能抑制成骨細(xì)胞增殖和分化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量和功能的改變,最終表現(xiàn)出骨壞死、骨質(zhì)疏松和減少骨形成.β-蛻皮甾酮(β-Ecd)為牛膝的活性成分之一.實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[4-5],一定劑量的β-Ecd可提高成骨細(xì)胞的活性而同時(shí)抑制破骨細(xì)胞的活性,有效干預(yù)糖皮質(zhì)激素所致小鼠骨密度的下降.也有報(bào)道β-Ecd對(duì)成骨樣細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用[6].但關(guān)于β-Ecd對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化影響的文獻(xiàn)報(bào)道并不多.本研究通過(guò)體外分子實(shí)驗(yàn),觀察補(bǔ)腎中藥牛膝活性成分β-Ecd干預(yù)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞的分化及影響情況,探討其防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制,以期為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4~5周齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供,體重180~220g,許可證號(hào)SCXK(滬)2016-0004.

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 β-Ecd購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司;地塞米松(Dex)注射液購(gòu)自浙江仙踞制藥股份有限公司;阿侖膦酸鈉注射液購(gòu)自青島捷世康生物科技有限公司;含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;ALP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司.

1.3 方法 (1)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞的培養(yǎng):取4~5周齡清潔級(jí)Wistar雄性大鼠,麻醉后頸椎脫臼處死,無(wú)菌狀態(tài)下分離股骨和脛骨,剔凈周?chē)浗M織.剪除兩端骨組織,暴露骨髓腔,緩慢從一端注入含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基,以沖出骨髓內(nèi)細(xì)胞.輕柔吹打數(shù)次,40μm過(guò)濾器過(guò)濾,得到單細(xì)胞懸液.離心5min(1500 r/min)后,棄上清液,用含10%FBS、100U/ml青霉素和100mg/L鏈霉素的DMEM/F12制成單細(xì)胞懸液,接種于25cm培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),放置于37℃、濕度100%、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).換液1次/3d.待原代細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)瓶底>80%時(shí),加入0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)至第3代.然后將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于密度為5X104的24孔板中,在含10% FBS、50mg/L維生素C、10-3mol/L b-甘油磷酸鈉、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素和10-8mol/LDex的成骨細(xì)胞優(yōu)化培養(yǎng)液中,放置于37℃、濕度100%、5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).誘導(dǎo)14d后,采用堿性磷酸酶(ALP)染色法對(duì)分化的成骨細(xì)胞加以鑒定.(2)不同濃度Dex對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性影響的檢測(cè):成骨細(xì)胞在96孔板上進(jìn)行培養(yǎng),用不同濃度Dex(10-9~10-4mol/L)處理成骨細(xì)胞72h,用ALP試劑盒測(cè)定ALP活性.(3)β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的干預(yù)作用:實(shí)驗(yàn)分組:將所培養(yǎng)的成骨細(xì)胞在12d后進(jìn)行分組,分為空白對(duì)照組(未予任何藥物干預(yù))、Dex組、Dex+阿侖膦酸鈉(ALN)組;Dex(Dex)+β-Ecd組.細(xì)胞增殖及ALP表達(dá)檢測(cè):成骨細(xì)胞在96孔板上進(jìn)行培養(yǎng),在加入Dex基礎(chǔ)上,分別加入阿侖膦酸鈉(10-5mol/L)、β-Ecd(10-4~10-9mol/L,上海純優(yōu)生物科技有限公司,中國(guó)上海),作用處理24h、48h、72h,在處理結(jié)束時(shí)(24h、48h和72h),細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑法(CCK-8)(BioTek Instruments,USA)檢測(cè)細(xì)胞增殖,用分光光度法測(cè)定了450nm處的吸光度.用ALP試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞ALP的表達(dá).RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA 表達(dá):設(shè)計(jì)相關(guān)基因的引物(Runx2,RANKL,OCN,ATG5等).將各引物溶解、稀釋成10μmol/L濃度,低溫凍存.用Trizol提取各組細(xì)胞總RNA,將RNA溶于Formamide,分裝,低溫保存.將RNA溶液用Biophotometer 檢測(cè)RNA含量(μg/μl).以5μg RNA為模板,利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶將各組細(xì)胞RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,將各cDNA低溫凍存?zhèn)溆?實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀檢測(cè)各組細(xì)胞各基因表達(dá)情況.以2-△△CT法檢測(cè)各組細(xì)胞各基因表達(dá)豐度.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5軟件及GraphPad軟件分析.計(jì)量資料以(±s)表示,采用非配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化及Dex、ALE、β-Ecd對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用 誘導(dǎo)14d后,成骨細(xì)胞開(kāi)始發(fā)育,細(xì)胞外基質(zhì)呈強(qiáng)紫色,表明成骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功.與空白對(duì)照組比較,Dex在較低濃度(10-9~10-8mol/L)下能明顯刺激ALP活性,在較高濃度(10-7~10-4mol/L)時(shí)抑制ALP活性,且兩者均呈劑量依賴(lài)性.不同濃度的β-Ecd(10-7~10-5mol/L)對(duì)ALP活性的刺激作用與單獨(dú)使用Dex(10-6mol/L)和ALE(10-5mol/L)相似.

2.2 β-Ecd對(duì)成骨分化的誘導(dǎo)作用 Dex(10-6mol/L)能顯著降低Runx 2和OCN的表達(dá),而RANKL在mRNA和蛋白質(zhì)水平上則均表現(xiàn)為顯著增加(圖1AD).不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞Runx2、OCN和RANKL表達(dá)的變化呈劑量依賴(lài)性逆轉(zhuǎn)作用(圖1A~D).

2.3 β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較,低濃度Dex(10-9~10-8mol/L)處理24h后細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)(圖2A),而高濃度(10-6~10-4mol/L)則抑制細(xì)胞增殖(圖2B、C).不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd作用24h對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯促進(jìn)作用(圖2D),但作用48h、72h與單用Dex(10-6mol/L)處理比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2E、F).

3 討論

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組對(duì)Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞Runx 2、OCN和RANKL表達(dá)的影響

圖2 β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖的影響

在體外分化過(guò)程中,成骨細(xì)胞表型標(biāo)志依次為Ⅰ型膠原基質(zhì)的形成、ALP的表達(dá)、Runx2的表達(dá)、骨鈣素(OCN)的分泌以及骨結(jié)節(jié)的礦化.其中Runx2是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子,控制著諸多隨后發(fā)生的成骨分化相關(guān)基因表達(dá)事件.ALP是與骨形成有關(guān)的代謝指標(biāo),是成骨細(xì)胞發(fā)揮成骨作用的關(guān)鍵酶,能直接反映成骨細(xì)胞活性,是骨折愈合和骨重建的重要生物標(biāo)志.本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的β-Ecd(10-7~10-5mol/L)對(duì)ALP活性有促進(jìn)作用,其刺激作用和ALE(10-5mol/L)相似.研究[7]還發(fā)現(xiàn)BMP、RunX2、ALP、Osteonectin等基因是BMSCs成骨分化過(guò)程中比較關(guān)鍵的基因.而且BMP還是BMP-2骨細(xì)胞分化信號(hào)通路的主要成員之一,RunX2是BMP-2的靶基因,兩者互為信號(hào)通路作用的關(guān)鍵因子,通路激活能夠促進(jìn)成骨分化,并調(diào)節(jié)分化過(guò)程中ALP、Osteonectin等相關(guān)基因的表達(dá),對(duì)骨組織的重建有重要的意義.OCN是另一個(gè)在分化過(guò)程中表達(dá)較晚的標(biāo)記.RANKL是一種膜結(jié)合腫瘤壞死因子(TNF)受體,其主要由成骨細(xì)胞和"T"淋巴細(xì)胞分泌的跨膜蛋白組成,表達(dá)于成骨細(xì)胞前體細(xì)胞上,通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞的直接相互作用識(shí)別破骨細(xì)胞表面的秩[8].在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)ALP表達(dá)檢測(cè)、RT-PCR及蛋白質(zhì)提取與蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Dex(10-6mol/L)能顯著降低Runx 2和OCN的表達(dá),而RANKL在mRNA和蛋白質(zhì)水平上則均表現(xiàn)為顯著增加,并顯示Dex對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響與其濃度和實(shí)驗(yàn)條件密切相關(guān).不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd對(duì)Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞Runx2、OCN和RANKL表達(dá)的變化有依賴(lài)性的逆轉(zhuǎn)作用,類(lèi)似于ALE(10-5mol/L)對(duì)成骨細(xì)胞的作用.

另有研究[9]報(bào)道成骨細(xì)胞是糖皮質(zhì)激素作用于骨的主要位點(diǎn),成骨細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素有特異性受體并且具有高度親和力,并通過(guò)與其特異性受體結(jié)合.生理劑量的糖皮質(zhì)激素是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞前體的聚集、成熟,進(jìn)入刺激成骨細(xì)胞分化.而超生理劑量則可抑制成骨細(xì)胞的增殖、分化,導(dǎo)致骨形成減少.本實(shí)驗(yàn)中高濃度Dex(10-6~10-4mol/L)表現(xiàn)為抑制成骨細(xì)胞增殖.而不同濃度(10-7~10-5mol/L)的β-Ecd作用48h、72h,則對(duì)成骨細(xì)胞增殖有較為明顯促進(jìn)作用.這一結(jié)果也進(jìn)一步表明β-Ecd對(duì)激素性骨質(zhì)疏松的正面干預(yù)作用.

綜上所述,本研究中成功建立了Dex誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞模型,為糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松癥的基礎(chǔ)研究提供細(xì)胞來(lái)源,并初步明確了Dex對(duì)成骨細(xì)胞分化和增殖的影響,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)β-Ecd能以劑量依賴(lài)性的方式逆轉(zhuǎn)Dex對(duì)成骨細(xì)胞分化和增殖的抑制.這些結(jié)果將為β-Ecd治療糖皮質(zhì)激素骨質(zhì)疏松癥提供強(qiáng)有力的理論支持.