丙泊酚抑制過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡作用機(jī)制的初步研究

馬斌 ，湯光耀 ，王麟堯 ，姜玉峰 ，呂海龍

1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肝膽外科，新疆石河子，832008；2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系，新疆石河子，832002

囊性包蟲病是由細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的幼蟲階段引起的人畜共患病，成全球性分布。該病是一種人畜共患疾病，嚴(yán)重危害人類健康，一旦發(fā)病治療比較復(fù)雜，病情嚴(yán)重者愈后較差[1-2]。人類因口服寄生蟲卵而感染。卵在胃腸道中孵化，穿透腸壁，進(jìn)入血液，最終可定居在人體的多種器官，在侵犯臟器中生成囊泡產(chǎn)生占性效應(yīng)，囊泡一旦破裂會(huì)產(chǎn)生并發(fā)癥[3]。據(jù)臨床調(diào)查報(bào)告，該病在肝臟組織中最為常見，約占75%，其次是肺，約占15%，脾，腎，骨，腦及其他器官中亦可見到[4-5]。這是一個(gè)全球公共衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)問題，主要流行于世界范圍內(nèi)的畜牧地區(qū)。隨著醫(yī)療環(huán)境及技術(shù)水平的發(fā)展,在此種術(shù)式的基礎(chǔ)上，為提高手術(shù)的成功率及改善患者愈后，有多種手術(shù)方式相繼推廣，如肝包蟲內(nèi)囊摘除術(shù)+外囊部分摘除術(shù)、肝部分切除術(shù)及肝包蟲囊腫超聲引導(dǎo)穿刺。傳統(tǒng)手術(shù)方式在肝包蟲的治療上有很重要的歷史地位,是臨床上最常用的方法。許多臨床問題是傳統(tǒng)手術(shù)無法避免的,如術(shù)后復(fù)發(fā)率高(4.5%～20.2%)[6-9]和并發(fā)癥多(8.8%～65.8%)等[7,10-11]。

近年來越來越多的研究有關(guān)于包蟲的藥物治療，但是效果不明顯。該研究通過初步探討丙泊酚抑制過氧化氫誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)凋亡的作用機(jī)制，了解細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)可以增HO-1酶活性及降低ROS水平起到自我保護(hù)作用，希望為囊性棘球蚴病的治療提供一個(gè)新的有針對性的治療方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料

取含有包蟲囊泡的羊肝，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用注射器抽出原頭節(jié)，備用。丙泊酚購于西安立邦有限公司；H2O2、HO-1及ROS試劑盒購于南京建成生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、RPMI 1 640培養(yǎng)基及小牛血清購于美國sigma公司。

1.2 體外培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)

將自然感染細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)的綿羊肝臟清水沖洗干凈后用75%醫(yī)用酒精消毒肝臟表面，無菌注射器反復(fù)抽吸囊泡內(nèi)的囊液及原頭節(jié)，集中在無菌瓶內(nèi)棄去囊液保留原頭節(jié)。超凈臺(tái)內(nèi)將提取后的原頭節(jié)使用PBS（已高壓）洗掉原頭節(jié)內(nèi)的雜質(zhì)，待離心管內(nèi)的PBS清亮及原頭節(jié)沉降速度接近同步且較快時(shí)（活性好的原頭節(jié)比重高在水中沉降速率快），停止清洗。將原頭節(jié)在PBS內(nèi)混勻隨機(jī)抽取約200～300個(gè)原頭節(jié)進(jìn)行伊紅染色約5 min，在倒置顯微鏡現(xiàn)觀察原頭節(jié)活力（活力好的原頭節(jié)拒染，死亡的及活力差的原頭節(jié)紅染）。反復(fù)使用PBS清洗，保證原頭節(jié)活力在95%左右。然后將保留的原頭節(jié)放入含有小牛血清及雙抗的RPMI 1 640培養(yǎng)基中，放于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及觀察原頭節(jié)活力

實(shí)驗(yàn)分為DMSO空白對照組，丙泊酚（0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L） 模型對照組，0.5 mmol/L H2O2組，丙泊酚（0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L）預(yù)處理8 h+0.5 mmol/L H2O2組。按實(shí)驗(yàn)分組在六孔板內(nèi)加藥后，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組原頭節(jié)活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Elisa檢測HO-1酶活力

取0.5 mmol/L H2O2組及1 mmol/L丙泊酚預(yù)處理8 h+0.5 mmol/L H2O2組作用6 h后的原頭節(jié)，PBS清洗3次。每 3 000個(gè)原頭節(jié)中加入150 μL裂解液，超聲破碎，在4℃、12 000轉(zhuǎn)條件下高速離心10 min后，抽取上清液。按照HO-1檢測試劑盒步驟將反應(yīng)體系加入96孔板中，于37℃避光孵育，待顏色變化較明顯時(shí)，用Bio-RAD酶標(biāo)儀檢測吸光度（A405值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 ROS水平的測定

取0.5 mmol/L H2O2組及1 mmol/L丙泊酚預(yù)處理8 h+0.5 mmol/LH2O2組作用6 h后的原頭節(jié)，PBS清洗3次后，更換含DCFH-DA10 μmol/L無血清培養(yǎng)基，37℃避光孵育1 h，棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，靜置，待自然沉淀后收集原頭節(jié)，用Bio-RAD熒光酶標(biāo)儀檢測DCFH OD值，488 nm激發(fā)波長，525 nm發(fā)射波。然后用PBS清洗3次，并在熒光顯微鏡下觀察原頭節(jié)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析 （ANOVA）和最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同實(shí)驗(yàn)組藥物作用后原頭節(jié)活力的變化

不同濃度的丙泊酚作用于原頭節(jié)24 h的活力曲線見圖1a，各組原頭節(jié)活力均大于95.0%。實(shí)驗(yàn)表明丙泊酚對原頭節(jié)無毒性作用。丙泊酚抑制過氧化氫誘導(dǎo)原頭節(jié)的凋亡見圖1b用丙泊酚（0.5～1 mmol/L）處理原頭節(jié)8 h后，在新鮮的培養(yǎng)基中再加入0.5 mmol/L H2O2共培養(yǎng) 6 h。0.5 mmol/L、0.75 mmol/L 和 1 mmol/L丙泊酚組對應(yīng)原頭節(jié)存活率分別為48.0%,58.0%和65.5%。單獨(dú)使用0.5 mmol/L H2O2培養(yǎng)丙泊酚6 h原頭節(jié)的活力為38.0%。結(jié)果表明丙泊酚抑制原頭節(jié)在過氧化氫中的凋亡，且具有濃度依賴性。

2.2 過氧化氫及丙泊酚作用后原頭節(jié)中HO-1酶的表達(dá)

0.5 mM H2O2處理細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)6 h及1 mM丙泊酚預(yù)處理原頭節(jié)8 h后加入0.5 mM H2O2培養(yǎng)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)6 h后分別進(jìn)行HO-1酶檢測結(jié)果如圖2所示。單獨(dú)使用H2O2原頭節(jié)內(nèi)HO-1酶活性較對照組稍增加，而使用丙泊酚預(yù)處理過的原頭節(jié)體內(nèi)HO-1活性表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 過氧化氫及丙泊酚作用后原頭節(jié)中ROS水平的變化

DCFH-DA染色法熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)0.5mmol/L H2O2及1 mmol/L丙泊酚組均可見綠色熒光，加入丙泊酚組熒光強(qiáng)度較0.5 mmol/L H2O2組明顯降低?？芍捶涌梢约せ钤^節(jié)內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 見圖 3。

3 討論

臨床中手術(shù)治療作為首選。包蟲病的現(xiàn)代手術(shù)治療不僅創(chuàng)傷小且提高了治愈率并降低了并發(fā)癥。但是對于一些復(fù)雜的病例也無能為力，如包蟲侵犯第一肝門或者位置較深難以完全切除。歸根結(jié)底產(chǎn)生并發(fā)癥的主要原因是因手術(shù)切除不徹底，或有活性的原頭節(jié)外溢引起的復(fù)發(fā)。因此，對于改善手術(shù)治療不徹底、術(shù)中原頭節(jié)外漏或者晚期包蟲病患者的生活質(zhì)量，藥物治療不可缺少。

Gu J等[12]發(fā)現(xiàn)丙泊酚誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞中血紅素加氧酶1(HO-1)表達(dá)升高抵抗H2O2的破壞作用。實(shí)驗(yàn)中使用不用濃度的丙泊酚培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞觀察丙泊酚無毒性。單獨(dú)使用1 mmol/L H2O2處理SHSY5Y細(xì)胞24 h，細(xì)胞生存率為48%。使用25 μM，50 μM，75 μM，100 μM 丙泊酚預(yù)處理 SH-SY5Y 細(xì)胞8 h后加入1 mmol/L H2O2共培養(yǎng)24 h細(xì)胞的生存率分別為60.94%，72.19%，80.43%，87.3% 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)思路，為明確包蟲抵抗氧化應(yīng)激的自我機(jī)制，以丙泊酚與過氧化氫體外誘導(dǎo)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)，觀察原頭節(jié)內(nèi)ROS及HO-1的表達(dá)。明確包蟲自我保護(hù)機(jī)制，為進(jìn)行有針對性的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

圖1 不同實(shí)驗(yàn)組之間原頭節(jié)活力的變化

圖2 各組藥物作用后HO-1酶活性變化

圖3 A：0.5 mM H2O2處理組（×100） B:1 mM丙泊酚+0.5 mM H2O2處理組（×100） C:ROS熒光強(qiáng)度

該實(shí)驗(yàn)研究顯示0.5 mmol/L H2O2體外作用于原頭節(jié)6 h，原頭節(jié)的活力為38.0%，而使用0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L的丙泊酚分別預(yù)處理原頭節(jié)8 h后加入0.5 mM H2O2，6 h后觀察原頭節(jié)的活力分別48.0%,58.0%和65.5%。結(jié)果表明活性氧具有明顯的殺蟲作用，丙泊酚抑制H2O2誘導(dǎo)原頭節(jié)凋亡。與Gu J等在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)研究結(jié)果相似，因此通過探索這種保護(hù)機(jī)制進(jìn)一步明確原頭節(jié)的自我保護(hù)作用。通過探討原頭節(jié)自我保護(hù)的機(jī)制，有針對性的研發(fā)分子靶向藥物。

外來有害物質(zhì)或異物入侵機(jī)體后，主要通過兩個(gè)階段代謝過程清除異物。第一階段為機(jī)體通過對異物的氧化、還原、羥化、水解作用使其失活。第二階段為宿主通過激活自身的抗氧化酶GST、SOD、HO-1及NQO-1等的催化作用清除侵入機(jī)體的氧化性或毒性有害物質(zhì)，防止對DNA、功能蛋白或膜脂產(chǎn)生損害，從而起到抗氧化、解毒及抗癌作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)可以代謝H2O2[14]。因此推測原頭節(jié)內(nèi)存在抗氧化酶，同時(shí)參與抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，并能消除活性氧從而保護(hù)自身免受氧化損傷。因此這些抗氧化酶在原頭節(jié)長期寄生在人體或其他宿主體內(nèi)起著關(guān)鍵作用[15]。在寄生蟲體內(nèi)，抗氧化劑（TPx）是一種重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，他可以起到維持寄生蟲細(xì)胞周期、能量轉(zhuǎn)換和生長發(fā)育的作用[16]。研究證實(shí)，細(xì)粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)的抗氧化劑EgTPx不僅可以幫助原頭節(jié)避開宿主的免疫攻擊，同時(shí)還可以保護(hù)自身抵抗由宿主代謝產(chǎn)生的ROS引起的氧化損傷。

該研究中，觀察到丙泊酚可以抑制過氧化氫誘導(dǎo)原頭節(jié)的凋亡，且具有濃度依賴性。HO-1活性檢測顯示1 mmol/L丙泊酚組HO-1表達(dá)活性明顯高于低濃度組（0.5 mmol/L、0.75 mmol/L丙泊酚）。原頭節(jié)內(nèi)ROS水平檢測發(fā)現(xiàn)丙泊酚濃度越高，ROS水平越低，與HO-1表達(dá)趨勢相反。因此有理由推測，丙泊酚通過增加HO-1酶活性來抵抗ROS引起的氧化損傷。因此該文以HO-1相關(guān)蛋白通路為靶點(diǎn)，有針對性地開發(fā)抗包蟲藥物。