補(bǔ)肺湯對(duì)慢性阻塞性肺疾病肺氣腫大鼠血清IFN-γ、IL-4表達(dá)水平影響研究*

王珊珊,譚光波

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長沙 410208)；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院(長沙 410006)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstruetive pulmonary diseases，COPD)是一種全球范圍內(nèi)廣受關(guān)注的慢性疾病和主要的死亡原因[1]，目前是第4位死因[2]。肺氣腫是慢性阻塞性肺疾病最為重要的病理改變之一，當(dāng)其進(jìn)行性發(fā)展到一定的嚴(yán)重程度時(shí)，會(huì)成為COPD氣流受限中的主導(dǎo)因素[3]。中醫(yī)學(xué)中并沒有關(guān)于COPD肺氣腫的記錄，但據(jù)它的臨床癥狀表現(xiàn)及特征，現(xiàn)在基本將其歸于“喘證”、“肺脹”、“咳嗽”等范圍[4]。近年來，隨著中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中醫(yī)藥治療COPD肺氣腫也越來越得到廣泛的關(guān)注。有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[5]，COPD肺氣腫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型存在肺氣虛癥狀表現(xiàn)，這與其病因病機(jī)有一定的相關(guān)性[6]，本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典補(bǔ)氣方藥補(bǔ)肺湯對(duì)COPD肺氣腫模型大鼠進(jìn)行治療，觀察補(bǔ)肺湯對(duì)COPD肺氣腫的療效和可能存在的作用機(jī)制，為臨床運(yùn)用補(bǔ)肺湯治療COPD肺氣腫提供依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為清潔級(jí)健康SD大鼠，共40只，性別均為雄性，鼠齡為7周，體重(200±20)g，由湖南省衛(wèi)生防疫站實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 實(shí)驗(yàn)藥物 脾氨肽口服凍干粉，2 mg/瓶，浙江豐安生物制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H10970214)。補(bǔ)肺湯免煎顆粒(由黃芪30 g，人參、紫菀各10 g，熟地黃20 g，桑白皮15 g，五味子5 g組成)；由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供。脂多糖，購自成都康斯坦科技有限公司，由美國Sigma公司生產(chǎn)。相思鳥牌香煙(煙氣中一氧化碳含量14 mg，焦油量13 mg，尼古丁含量1.1 mg)，由湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。

3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑 搖床：其林貝爾TS-92；恒溫箱北京六一DYY-6C；微波爐：美的MM721AAU-PW；切片刀萊卡M199；切片機(jī)：浙江金華益迪試驗(yàn)器材YD-315；包埋機(jī)：常州中威電子儀器BMJ-A；普通冰箱：榮事達(dá)BCD-245F；精密pH計(jì)：雷磁E-201-C；顯微鏡：MoticBA210T；蓋玻片：海門遠(yuǎn)泰DY89-1；載玻片：海門遠(yuǎn)泰AY89-2；常規(guī)化學(xué)試劑：上海國藥生物；石蠟：Sigma；中性樹膠Sigma；蘇木素PBS(7.2-7.6)Sigma。大鼠IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供。

4 造模及分組給藥 40只清潔級(jí)健康SD大鼠隨機(jī)分成四組：空白對(duì)照組、模型組、西藥對(duì)照組，中藥治療組，每組10只，模型組、西藥對(duì)照組、中藥治療組均予以氣道內(nèi)注射脂多糖加被動(dòng)煙熏建立COPD肺氣腫動(dòng)物模型[7]，將大鼠置密閉煙熏箱內(nèi)，予相思鳥牌香煙每次10支點(diǎn)燃后煙熏，2次/d，40 min /次，間隔 6 h，共 70 d。第 20、50 天使用水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，暴露氣管，氣道內(nèi)注入脂多糖 200 μl(1 g /L) ，旋轉(zhuǎn)固定板，使脂多糖均勻分布兩肺?？瞻讓?duì)照組置于同樣密閉箱，于第 20、50天氣管內(nèi)注入等量生理鹽水，不予以被動(dòng)吸煙?？瞻讓?duì)照組和模型組于造模成功后第2天給予生理鹽水灌胃(5 ml/只)，中藥治療組給予補(bǔ)肺湯免煎顆粒沖兌灌胃(每劑沖兌為100 ml，稀釋至5 ml/只)，西藥對(duì)照組給予脾氨肽口服凍干粉灌胃(2 mg予生理鹽水10 ml稀釋，5 ml/只)，2次/d，共14 d。

5 標(biāo)本的收集和檢測 水合氯醛(2 ml/kg)腹腔麻醉給藥后開腹，下腔靜脈采血后分離血清，按照IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒使用說明書檢測血清IFN-γ、IL-4的含量。用手術(shù)刀切取大鼠右肺下葉組織，投入4%多聚甲醛溶液中固定常規(guī)脫水，石蠟包埋、切片，予HE染色，觀察病理形態(tài)改變。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。采用WPS Office繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣本濃度；計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)的統(tǒng)計(jì)方法，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠病理學(xué)變化比較 實(shí)驗(yàn)肺組織病理切片在HE染色后于光鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察，觀察圖像經(jīng)過比較后顯示：空白對(duì)照組大鼠的肺泡，血管，支氣管均未見異常，肺泡大小基本正常，且形狀規(guī)則，偶有斷裂，考慮在制作切片時(shí)人為物理因素所導(dǎo)致。西藥對(duì)照組、中藥治療組與模型組的肺內(nèi)肺泡管，肺泡囊，肺泡，細(xì)支氣管與對(duì)照組相比均明顯擴(kuò)大，肺泡壁變薄并且有多處斷裂，相鄰肺泡相互融合成較大的肺大庖。但西藥對(duì)照組、中藥治療組較模型組相比，上述病變有所減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠病理學(xué)變化(HE染色×100 )

2 各組大鼠血清中IFN-γ、IL-4含量變化 血清中IFN-γ、IL-4炎性因子的水平最終檢測標(biāo)本40例，其中空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、西藥對(duì)照組、中藥治療組各10例。

與空白對(duì)照組相比,模型組血清中IFN-γ含量明顯減少(P<0.01)；與模型組相比，中藥治療組血清中 IFN-γ含量均明顯增高(P<0.01)，見表1。與空白對(duì)照組相比,模型組血清中IL-4含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比，中藥治療組血清中IL-4含量均明顯減少(P<0.01)，見表2。與西藥對(duì)照組相比，中藥治療組血清中IFN-γ、IL-4的含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清中IFN-γ濃度(pg/ml)

注：模型組與空白對(duì)照組相比，*P<0.01；其余組與模型組相比， #P<0.01

表2 各組大鼠血清中IL-4濃度(pg/ml)

注：模型組與空白對(duì)照組相比， *P<0.01；其余組與模型組相比， #P<0.01

討 論

補(bǔ)肺湯出自《永類鈐方》，主治肺虛咳喘、氣短咳嗽等證，具有補(bǔ)肺益氣，止咳平喘之效[8]。全方由人參、黃芪、熟地黃、桑白皮、五味子、紫菀等6味藥物組成。人參，歸肺、脾、心經(jīng)，其功效大補(bǔ)元?dú)?，補(bǔ)脾益肺。久病肺虛是COPD肺氣腫的發(fā)病基礎(chǔ)[9]，可予以人參治其本。肺氣虛，通調(diào)水道失職，可見痰涎壅盛，COPD肺氣腫常見咳嗽咳痰等癥狀，脾為肺之母，“虛則補(bǔ)其母”，脾主運(yùn)化，健脾可化濕。黃芪歸脾、肺經(jīng)，其功效健脾補(bǔ)肺，益衛(wèi)固表[10]，黃芪與人參相須為用，肺脾同補(bǔ)可治療COPD肺氣腫之標(biāo)本。熟地黃具有補(bǔ)血養(yǎng)陰，填精益髓之功效，因?yàn)槟I為肺之子，腎精充足則喘?？戎?。方中桑白皮可清瀉肺火而兼瀉肺中水氣；五味子收澀補(bǔ)腎，益氣生津，上能斂肺氣，下能滋腎陰；佐以紫菀潤肺化痰止咳。諸藥合用，全方共奏補(bǔ)肺益腎，納氣平喘，止咳化痰之功，而方主以補(bǔ)肺氣為要?，F(xiàn)代多項(xiàng)研究也證實(shí)補(bǔ)肺湯對(duì)COPD肺氣腫患者有改善癥狀、增強(qiáng)免疫力等作用。王朝蘭等[11]的實(shí)驗(yàn)表明補(bǔ)肺湯可能是通過增加模型大鼠的免疫功能、抑制炎癥因子釋放、減輕肺與支氣管的病理學(xué)改變達(dá)到補(bǔ)益肺氣的目的。于河安等[12]的臨床研究表明，補(bǔ)肺湯對(duì)COPD肺氣腫患者具有良好的療效，能夠有效地改善患者的生活質(zhì)量，有利于患者病情的穩(wěn)定和改善。有研究表明[13]，補(bǔ)肺湯可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2的失衡，達(dá)到調(diào)節(jié)大鼠免疫功能的目的。

目前學(xué)界對(duì)關(guān)于影響COPD肺氣腫發(fā)生和發(fā)展可能存在作用機(jī)制并沒有完全統(tǒng)一的意見，一直以來彈力蛋白酶-抗彈力蛋白酶、慢性炎癥、氧化應(yīng)激等學(xué)說占據(jù)主流地位[14]。但是近年來隨著越來越多的廣泛實(shí)驗(yàn)研究和臨床觀察，T細(xì)胞介導(dǎo)的獲得性免疫可能參與了COPD肺氣腫的疾病發(fā)生發(fā)展過程的討論也得到了研究者們的重視[15]。Thl/Th2失衡極其可能在COPD肺氣腫發(fā)生發(fā)展中的占據(jù)重要的作用。到現(xiàn)在為止，大量的研究并沒有發(fā)現(xiàn)和Th1與Th2相關(guān)的具有特異性細(xì)胞表面標(biāo)志，所以學(xué)者都選擇通過其所分泌的細(xì)胞因子的不同來對(duì)Th1及Th2進(jìn)行區(qū)分和鑒別。Th1分泌的IFN-γ及Th2的釋放IL-4，都參與了機(jī)體自身的免疫反應(yīng)[16]。

本實(shí)驗(yàn)采用氣道內(nèi)注射脂多糖聯(lián)合被動(dòng)煙熏的方式建立COPD肺氣腫大鼠模型。實(shí)驗(yàn)中模型組大鼠肺組織HE染色切片在光鏡下病理改變明顯，與相關(guān)報(bào)道一致，提示本次實(shí)驗(yàn)建立的COPD肺氣腫大鼠模型成功[17]。臨床上關(guān)于補(bǔ)肺湯治療COPD肺氣腫有廣泛應(yīng)用。本次試驗(yàn)研究結(jié)果提示，補(bǔ)肺湯具有改善周圍氣道壁損傷及不規(guī)則修復(fù)，減輕肺泡擴(kuò)張及病理性融合的作用。補(bǔ)肺湯對(duì)能增加COPD肺氣腫大鼠血清中IFN-γ的分泌，減少血清中IL-4的分泌，其作用機(jī)理可能與調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡有關(guān)。

綜上所述，中醫(yī)經(jīng)典方劑補(bǔ)肺湯可能能夠通過減少血清中IL-4的生成和促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)來維持Thl細(xì)胞與Th2細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，起到良好的抗炎和調(diào)節(jié)免疫作用，減輕肺泡擴(kuò)張及病理性融合，但其最終并不能阻止COPD肺氣腫的形成，其機(jī)制仍需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察來進(jìn)行進(jìn)一步研究。