宮頸感染高危型人乳頭瘤病毒后microRNAs的表達(dá)及其臨床意義＊

張星瑩，楊春娜，于 慧，解水杉，孫曉娟，李連芹

盡管高危型人乳頭瘤病毒 （human papillomavirus，HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要原因，但宮頸癌發(fā)病是一個(gè)多因素參與、多步驟進(jìn)行的慢性過程。微小 RNAs（microRNA，miRNA）是一類廣泛存在于真核生物中的小分子非編碼RNA，通過與相關(guān)靶基因結(jié)合調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的各種生理病理過程，如細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等。近十幾年來，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、耐藥性等方面的作用一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)問題。大量的研究表明，很多種miRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)發(fā)生異常［1，2］，這些異常表達(dá)的 miRNA 與宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，甚至可以作為預(yù)測(cè)腫瘤患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)［3-5］。 該研究對(duì)感染HPV16的宮頸上皮細(xì)胞 （未發(fā)生癌變或癌前病變）中miRNA的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)，以探討miRNA在宮頸癌發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及來源該研究獲得濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者知情同意。宮頸上皮組織來自因子宮肌瘤或子宮內(nèi)膜異位癥接受手術(shù)治療的患者，穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6/E7的宮頸上皮永生化細(xì)胞系（H8）購自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。HPV檢測(cè)試劑盒由香港凱普公司生產(chǎn)，提取RNA用Trizol試劑購自美國(guó)Invitrogen公司，miRNA分離試劑盒購自美國(guó)Ambion公司，SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒購自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 宮頸感染HPV狀況的檢測(cè) 利用HPV檢測(cè)試劑盒測(cè)定宮頸組織的HPV感染狀況。從宮頸組織中提取RNA并通過PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物與雜交膜（含有21種HPV亞型探針，其中高危型15種，低危型6種）進(jìn)行雜交，雜交膜通過NBT/BCIP顯色，以確定HPV的感染與否及分型。

1.2.2 miRNA表達(dá)的微陣列分析 微陣列探針是一種寡聚核苷酸，其堿基序列與435種人類miRNA的堿基序列互補(bǔ)。首先從宮頸組織中提取總的RNA，再利用miRNA分離試劑盒分離出微小RNA，利用T4 RNA 連接酶進(jìn)行標(biāo)記，最后將含有1.5 μg的雜交液與微陣列雜交膜在42℃下雜交。次日經(jīng)清洗、空干之后，利用LuaxScan 10K/A 掃描儀（北京博奧公司生產(chǎn)）及微陣列顯著性分析軟件（significance analysis of microarray，SAM，version 2.1）對(duì)基因芯片進(jìn)行分析，以量化miRNA的表達(dá)差異。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR分析 為了驗(yàn)證微陣列分析結(jié)果，利用SYBR Green miRNA qRT-PCR試劑盒對(duì)表達(dá)異常的miRNA進(jìn)行定量分析。上游引物序列與待測(cè)基因的序列完全相同，下游引物是由廠家提供的通用引物。PCR反應(yīng)條件為：95℃3 min，95℃15 sec，60 ℃ 1 min×40； 反 應(yīng) 量 為 50 μl。 每 個(gè)miRNA的表達(dá)水平是相對(duì)于U6的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為 2-ΔCt×106，其中 Ct代表每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，ΔCt為每個(gè)miRNA基因與U6的閾值循環(huán)數(shù)之差，即ΔCt=（CtmiRNA-CtU6）。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析處理，所測(cè)miRNA的表達(dá)強(qiáng)度以（x±s）表示。對(duì)于兩組間年齡比較，采用t檢驗(yàn)法；對(duì)于miRNA表達(dá)水平的比較，采用單因素方差分析。取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1患者一般資料該研究選取了10例單純感染HPV16的宮頸標(biāo)本，其病理學(xué)檢查未見異常?；颊叩钠骄挲g（48.5±1.8）歲。另外，選取10例HPV陰性的正常宮頸作為對(duì)照，其平均年齡（49.8±1.2）歲。兩組病例的年齡無明顯差異。

2.2 miRNA的表達(dá)差異根據(jù)SAM的解釋，如果挑選表達(dá)差異在5倍以上的基因，可能會(huì)有1個(gè)基因是假陽性。而如果挑選表達(dá)差異在3～5倍之間的基因，可能會(huì)有2～3個(gè)基因是假陽性。因此，筆者挑選了表達(dá)差異在5倍以上的基因，而且這種差異出現(xiàn)在6個(gè)以上的所測(cè)標(biāo)本中。如表1所示，在HPV16 陽性的宮頸標(biāo)本中，miR-133a，miR-133b，和miR-196a的表達(dá)強(qiáng)度與對(duì)照組相比顯著降低。

表1 miRNA在HPV16型陽性的宮頸標(biāo)本中的表達(dá)差異倍數(shù)

2.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果為了驗(yàn)證微陣列分析結(jié)果，筆者采用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)上述3個(gè)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)。如圖1所示，miR-133a，miR-133b，和miR-196a在HPV16陽性的宮頸中的相對(duì)表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，而且在H8細(xì)胞系中表達(dá)降低更加明顯。

3 討論

圖1 miRNA的表達(dá)比較

截至目前，大多數(shù)有關(guān)miRNA與腫瘤相關(guān)性的研究集中于癌癥患者或者腫瘤細(xì)胞，而miRNA在腫瘤發(fā)病起始階段的作用卻鮮見報(bào)道。在宮頸癌發(fā)病過程中，高危型HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合是非常關(guān)鍵的一步。該研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)miRNA，其表達(dá)在感染HPV16的宮頸細(xì)胞中顯著降低。H8是一種永生化的宮頸上皮細(xì)胞，其中HPV16的E6/E7基因與宮頸上皮細(xì)胞的基因組發(fā)生了整合。miR-133a、miR-133b、miR-196a在 H8細(xì)胞系的表達(dá)進(jìn)一步降低，提示這些基因與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。

眾所周知，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的主要因素，而HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合是其中的關(guān)鍵步驟之一。研究發(fā)現(xiàn)，HPV的致癌基因與宿主細(xì)胞的基因組發(fā)生整合的位點(diǎn)常?？拷赾-Myc基因。之前的研究報(bào)告提出，HPV的致癌基因E6/E7和c-Myc直接作用于包括 miRNA-196 在內(nèi)的多個(gè) miRNA［6，7］，而 miRNA-196則對(duì)Hoxb8基因發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用［8］。Hoxb8是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)控細(xì)胞的分化［9］。因此推測(cè)HPV致癌基因與c-Myc、miR-196和Hoxb8之間，在宮頸癌的發(fā)病過程中存在相互作用關(guān)系。在該研究所確認(rèn)的3個(gè)miRNA中，miR-133a和miR-133b在各種不同的腫瘤中的表達(dá)均降低。國(guó)內(nèi)學(xué)者Song等研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a通過表皮生長(zhǎng)因子受體抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［10］，而根據(jù)Patron等人的報(bào)告，miR-133b在宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中具有促凋亡作用［11］。miR-133a和miR-133b在HPV16陽性的宮頸上皮細(xì)胞中的表達(dá)降低，提示此類細(xì)胞的凋亡可能受到抑制，或者有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，其結(jié)果促進(jìn)了HPV致癌基因的復(fù)制和整合，進(jìn)而在其他因素的作用下發(fā)生癌變。其中詳細(xì)的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。