MTERF2在乳腺癌組織中的表達及與臨床病理特征的相關(guān)性＊

王唯斯，自加吉，李素芬，李 彬，張 態(tài)，張若鵬，熊 偉

近年來，惡性腫瘤已成為全球范圍內(nèi)致死率第二位的疾病，嚴(yán)重危害人們的身心健康。而在眾多腫瘤疾病中，乳腺癌是全世界常見的惡性腫瘤［1］，也是我國45歲以下女性病死的主要原因［2］。乳腺癌患者的5年、10年、15年生存率分別為89%、83%和78%。但是仍有部分患者預(yù)后較差［3］。因此，深入探討其發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，尋找一種高敏感性分子標(biāo)志物，對乳腺癌的早期診斷、臨床治療及預(yù)后具有重要意義。人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子 （mitochondrial transcription termination factors，MTERFs） 是一類由核基因編碼，從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)，最后定位于線粒體，具有MTERF結(jié)構(gòu)域（即30個氨基酸殘基重復(fù)形成的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)）的蛋白質(zhì)［4］。研究表明，MTERFs分別參與線粒體DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控［5］。其中，人線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子2（MTERF2）又稱為線粒體轉(zhuǎn)錄終止樣因子（mitochondrial transcription termination-like factor，MTERFL）或線粒體轉(zhuǎn)錄終止因子結(jié)構(gòu)域3（mitochondrialtranscription termination factordomain containing 3，MTERFD3），屬于 MTERF 蛋白超家族的成員之一。MTERF2蛋白在哺乳動物心臟、肝臟及骨骼肌等新陳代謝旺盛的組織中表達較高［6］。前期研究表明，MTERF2是血清饑餓誘導(dǎo)表達的基因，在體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)過表達MTERF2基因?qū)⒓毎芷谧铚贕1/S期，對細胞生長和增殖有較強的抑制作用，但并不導(dǎo)致細胞凋亡［7］。 然而，MTERF2基因在乳腺癌組織中的表達水平和臨床意義目前尚未見報道。該研究通過實時熒光定量RT-PCR（qRT-PCR）和免疫組化方法，分別檢測MTERF2 mRNA和蛋白質(zhì)在人乳腺癌組織及其對應(yīng)癌旁組織中的表達水平和分布情況；通過癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集探討MTERF2與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系及其預(yù)后意義，以期為進一步闡明MTERF2基因在乳腺癌中發(fā)生發(fā)展的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1臨床資料與標(biāo)本收集大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科2016年1月1日—2018年6月1日手術(shù)切除后經(jīng)病理診斷確診為乳腺癌的標(biāo)本46例，離體后30 min內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱凍存。其中浸潤性導(dǎo)管癌29例，浸潤性小葉癌11例，混合性癌（導(dǎo)管內(nèi)癌及小葉癌）6例；患者均為女性，年齡38～70 歲，平均（53.25±16.75）歲，均為首次確診，手術(shù)前未經(jīng)化療、放療及免疫治療。同時取46例距其癌組織3 cm的癌旁組織做對照。該研究通過大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2015-06），所有研究對象均簽署知情同意書?；颊呤中g(shù)切除后的標(biāo)本分為兩部分，一部分用于MTERF2 mRNA的檢測，另一部分用于MTERF2蛋白的檢測［5］。所有用于免疫組化檢測的標(biāo)本均經(jīng)10%多聚甲醛浸泡固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm 連續(xù)切片。

1.2試劑與儀器兔抗人MTERFD3多克隆抗體（ab230120，美國Abcam公司），SP免疫組織化學(xué)實驗選擇的濃度為1∶50；SP免疫組織化學(xué)試劑盒及DAB顯色試劑盒 （福建邁新生物技術(shù)有限公司）；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×SYBR Green qPCR Mix熒光染料 （美國Invitrogen公司）；qRT-PCR引物（昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成）。主要儀器有高速低溫離心機（德國 Beckman Coulter公司）；7500 Fast Real Time PCR System （美國Applied Biosystem公司）；Nanodrop ND-100核酸蛋白定量儀 （美國Bio-Rad公司）；Motic數(shù)碼顯微鏡 （美國Motic公司）。

1.3方法

1.3.1 qRT-PCR檢測乳腺癌組織中MTERF2基因mRNA表達量 根據(jù)GenBank提供的MTERF2基因完整的轉(zhuǎn)錄本mRNA序列（NM_025198.4），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計PCR引物，并通過NCBI/Primer-BLAST網(wǎng)站進行引物同源性比較。引物序列見表1。各取凍存組織標(biāo)本100 mg，剪碎研磨，用TRIzol試劑采用一步法提取總RNA，用紫外分光光度計進行定量，OD260/OD280比值均為1.8～2.0，再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。qRTPCR 體系 20 μl：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl，上游、下游引物各 0.5 μl，cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水7 μl，同時制作標(biāo)準(zhǔn)品曲線。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 10 s、退火 30 s（β-actin 基因和MTERF2基因的退火溫度分別為55℃和58℃），熒光檢測，反應(yīng)40個循環(huán)，并繪制熔解曲線。每個樣本設(shè)置3個平行孔，取拷貝數(shù)均值進行統(tǒng)計分析。以β-actin基因mRNA作為內(nèi)參照，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線進行相對定量的方法，分別比較乳腺癌組織及其癌旁組織MTERF2基因mRNA的表達差異。實驗重復(fù)3次。

表1 MTERF2及內(nèi)參β-actin引物的序列

1.3.2 免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺癌組織中MTERF2蛋白表達 采用免疫組化SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。石蠟包埋組織切片，60℃烤箱烤15 min，切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液洗片水化。3%過氧化氫孵育5～10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的干擾。雙蒸水洗滌3次，于枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）中高壓抗原修復(fù)10 min，室溫下冷卻。用PBS沖洗3次，滴加山羊血清室溫封閉15min，去除血清后加入MTERF2一抗（1∶50），濕盒中 4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次，每次3 min。滴加生物素標(biāo)記二抗（1∶1000），室溫孵育 30 min，PBS 沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育15 min。加入DAB顯色劑10 min，顯微鏡下觀察顯色反應(yīng)，若切片中觀察到棕黃色顯色則立即用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。顯色后的切片蘇木精復(fù)染，1%鹽酸無水乙醇分化返藍，梯度乙醇溶液脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片，在顯微鏡下觀察并判斷染色結(jié)果。

1.3.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定 采用雙盲法，由2名資深病理醫(yī)師對免疫組化染色結(jié)果獨立進行閱片、評分。MTERF2蛋白的表達為胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色染色，根據(jù)免疫組化反應(yīng)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)進行評分。首先將染色強度進行評分：無色0分、淡黃色1分、棕黃色2分、黃褐色3分；再對陽性細胞所占百分比進行評分：顯微鏡下選5個視野先低倍后高倍進行觀察，每個視野計數(shù)100個細胞，算出5個視野陽性細胞所占百分比，然后進行評分：陰性0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。最后將每張切片兩種評分相乘為其染色分?jǐn)?shù)：0分為陰性，1～3分為弱陽性，4～6分為陽性，＞8分為強陽性。為方便統(tǒng)計，陽性和強陽性判定為陽性表達；其他的均定義為陰性表達。

1.3.4 TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)資料收集 使用R 2.15.3軟件，利用Epicalc函數(shù)包從美國公共癌癥基因數(shù)據(jù)庫 TCGA（http：//tcga-adtaa.nci.nih.gov/tcga/）下載并預(yù)處理乳腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達Seq V2數(shù)據(jù)，進行MTERF2 mRNA相對表達量的分析，同時下載臨床病理資料數(shù)據(jù)，進行臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析。

1.3.5 TCGA乳腺癌數(shù)據(jù)集篩選和臨床病理學(xué)參數(shù)相關(guān)性分析 通過數(shù)據(jù)下載得到的含有MTERF2 mRNA表達量的乳腺癌組織樣本1110例，同時下載1110例乳腺癌病例相對應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)和預(yù)后資料。通過對臨床資料數(shù)據(jù)進行篩選分析，剔除臨床病理參數(shù)不全或者不完整的病例以及缺乏預(yù)后隨訪資料的病例，僅保留TCGA數(shù)據(jù)集中包含臨床參數(shù)和生存資料的病例，最后得到含有完整臨床病理參數(shù)和生存資料的病例707例。根據(jù)mRNA二代測序結(jié)果分析，乳腺癌組織樣本中MTERF2表達量67.5778～1948.9697，中位數(shù)為365.1130。某一樣本MTERF2 mRNA表達水平大于中位數(shù)，則定義為MTERF2高表達；反之，則定義為MTERF2低表達。根據(jù)這個定義，乳腺癌組織中MTERF2高表達354例，低表達353例。

1.3.6 乳腺癌分子病理分型診斷標(biāo)準(zhǔn) TCGA數(shù)據(jù)集資料根據(jù) Perou等［8］發(fā)表的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)，將入庫的乳腺癌患者分為4類分子分型。（1）Lumial A 型：雌激素受體（estrogen receptor，ER）和（或）孕激素受體（progesterone receptor，PR）陽性（+），人表皮生長因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性（-）；（2）Lumial B 型：ER 和（或）PR（+），HER2（+）；（3）HER2 過表達型：ER（-），PR（-），HER2（+）；（4）Basal like 型：ER（-），PR（-），HER2（-），CK5/6（+）和（或）表皮生長因子受體 （epidermal growth factor receptor，EGFR）陽性（+）。

1.3.7 利用Kaplan-Meier模型進行乳腺癌患者生存分析 利用R 2.15.3軟件從TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理的乳腺癌患MTERF2 mRNA表達量和生存資料，使用Kaplan-Meier模型，對乳腺癌患者進行預(yù)后生存分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法建立乳腺癌患者臨床病理資料庫，將患者年齡、AJCC癌癥病理分期、分子分型、T分期、M分期、N分期、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、HER2狀態(tài)、病理分型和MTERF2 mRNA表達水平等指標(biāo)進行量化賦值［9］，見表2。全部資料輸入計算機進行統(tǒng)計學(xué)分析，使用R 2.15.3與Graphpad 7.01軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及繪圖，使用Shapiro-Wilk檢測乳腺癌組織中MTERF2 mRNA表達水平兩組數(shù)據(jù)正態(tài)分布情況，結(jié)果顯示MTERF2 mRNA表達水平不符合正態(tài)分布。因此，乳腺癌組織的MTERF2 mRNA表達水平的比較采用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗，臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析，組間比較采用χ2檢驗及Fisher確切概率法，生存分析采用Kaplan-Meier模型，單因素和多因素分析采用Cox風(fēng)險比例回歸模型，雙側(cè)檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 MTERF2 mRNA在乳腺癌組織中的表達將配對癌旁組織中的MTERF2 mRNA表達量設(shè)為對照，所對應(yīng)的乳腺癌組織與配對癌旁組織的MTERF2表達水平進行比較，結(jié)果表明，乳腺癌組織中MTERF2 mRNA表達水平下降的樣本占93.48%（43/46），表達不變或增多的樣本僅占6.52%（3/46）。將癌旁組織中MTERF2 mRNA的表達水平標(biāo)準(zhǔn)化為1.0，MTERF2在46例乳腺癌組織中的相對表達量為0.292±0.034，其中最低值為0.020，最高值為1.328。qRT-PCR結(jié)果顯示，MTERF2 mRNA在乳腺癌組織中的表達量顯著低于對應(yīng)的癌旁組織中的表達量（P=0.013），見圖 1。

表2 乳腺癌患者預(yù)后影響因素及其賦值

圖1 46例乳腺癌組織中MTERF2 mRNA的相對表達量（n=46）

2.2MTERF2蛋白在乳腺癌組織中的表達免疫組化染色結(jié)果顯示，乳腺癌組織中MTERF2蛋白陽性染色定位于細胞質(zhì)中，呈棕黃色細顆粒狀，細胞核內(nèi)無表達。MTERF2在46例癌旁組織中均為中等強度的表達，且46例癌旁組織中MTERF2的表達未見明顯差異。在46例乳腺癌組織中，10例（21.74%）樣本為陰性表達，33例（71.74%）樣本為弱陽性表達，6例（6.52%）為中等強度表達。以各組癌旁組織為對照，93.48%的乳腺癌組織中MTERF2表達下降，僅6.52%的乳腺癌組織中出現(xiàn)中度表達。免疫組化評分結(jié)果提示，MTERF2蛋白在乳腺癌組織中的表達量顯著低于對應(yīng)的癌旁組織中的表達量（P=0.020），此結(jié)果與qRT-PCR檢測的結(jié)果趨勢基本一致，見圖2。

圖2見封三。

2.3乳腺癌組織MTERF2表達及其臨床病理相關(guān)性在TCGA數(shù)據(jù)庫下載并整理得到臨床病理參數(shù)完整707例乳腺癌病例資料，其中女性669例，男性8例，年齡28～90歲，中位年齡58歲。對該數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者預(yù)后的各影響因素進行賦值，通過統(tǒng)計學(xué)分析得知，其中乳腺癌組織中MTERF2低表達353例，MTERF2高表達354例。MTERF2 mRNA表達量與乳腺癌患者的ER狀態(tài) （χ2=55.10，P＜0.001）、PR 狀態(tài)（χ2=72.22，P＜0.001）、乳腺癌分子分型（χ2=56.53，P＜0.001）、癌癥類型（χ2=20.48，P＜0.001）以及組織學(xué)診斷類型（χ2=21.88，P＜0.001）存在顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、性別、T分期、N分期、M分期、AJCC病理分期、HER2狀態(tài)、有無惡性腫瘤病史以及原發(fā)部位無顯著相關(guān)性（均P＞0.05），見表3。

2.4MTERF2 mRNA表達水平與乳腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性為了明確MTERF2 mRNA表達量與乳腺癌之間的預(yù)后關(guān)系，該研究利用在TCGA數(shù)據(jù)庫下載的乳腺癌數(shù)據(jù)集中提取的MTERF2乳腺癌患者預(yù)后相關(guān)參數(shù)，并運用Kaplan-Meier模型進行分析。結(jié)果表明，MTERF2 mRNA表達水平與乳腺癌患者總生存率（overall survival，OS）無關(guān)（Logrank，P=0.329）。MTERF2 mRNA 表達水平與乳腺癌患者無病生存率（disease-free survival，DFS）也無關(guān)（Log-rank，P=0.371），見圖 3。 MTERF2 mRNA 高表達的乳腺癌患者與MTERF2 mRNA低表達的乳腺癌患者無論在總生存時間［（35.96±31.29）個月vs.（34.58±29.84）個月］還是在無疾病進展生存時間［（33.22±29.00）個月 vs. （33.24±29.41）個月］都無明顯差異（P＞0.05）。

表3 MTERF2 mRNA表達量與乳腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

圖3見封三。

2.5影響乳腺癌患者預(yù)后的臨床病理因素的單因素和多因素分析進一步對影響乳腺癌預(yù)后的影響因素利用Cox比例風(fēng)險回歸模型（proportional hazards model）進行單因素分析和多因素分析，在單因素分析的結(jié)果顯示，乳腺癌患者的年齡、分子分型、T分期、N分期、M分期、AJCC病理分期以及癌癥類型與乳腺癌患者的預(yù)后存在顯著相關(guān)（均P＜0.05）。ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、有無惡性腫瘤病史、組織學(xué)診斷類型以及MTERF2 mRNA表達量與乳腺癌患者的預(yù)后無顯著相關(guān)（均P＞0.05）。對上述影響乳腺癌患者生存預(yù)后的因素納入Cox比例風(fēng)險回歸模型進行多因素分析，在多因素分析的結(jié)果顯示，乳腺癌患者的年齡、M分期以及癌癥類型均是乳腺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)后因素（均P＜0.05），見表4。無論在Kaplan-Meier模型還是Cox比例風(fēng)險回歸模型，結(jié)果都表明MTERF2 mRNA在乳腺癌中的表達量與患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性。

表4 影響乳腺癌患者預(yù)后的臨床病理因素的Cox比例風(fēng)險回歸分析

3 討論

乳腺癌是全世界女性癌癥死亡的主要原因，其發(fā)病率持續(xù)上升［10］。雖然隨著醫(yī)療的發(fā)展，治療的改善，乳腺癌的生存率在過去的30年中有了顯著的提高，但是它在女性癌癥死亡中仍然位居第二位［11］。治療失敗和遠處轉(zhuǎn)移一直是乳腺癌治療的主要挑戰(zhàn)［12］。因此，探索更多的分子標(biāo)志物來預(yù)測治療的敏感性、腫瘤的進展和潛在的靶向治療日益變得重要［13，14］。 人 MTERF 蛋白家族共有 4 個成員，分別是MTERF1～MTERF4，它們在線粒體基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄與翻譯過程中發(fā)揮調(diào)控作用［15］。Chen 等［16］研究表明，MTERF2定位于人類細胞線粒體內(nèi)，是一個血清饑餓誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)。過表達MTERF2基因?qū)⒓毎芷谧铚贕1/S期，且對細胞增殖有較強的抑制作用，但并不導(dǎo)致細胞凋亡。人MTERF2是線粒體基因表達的重要調(diào)控因子，其在乳腺癌中的表達與乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后之間的關(guān)系，目前尚未見報道。

該研究中，筆者首先采用qRT-PCR檢測46例乳腺癌組織及其配對癌旁組織中MTERF2 mRNA表達水平，結(jié)果顯示，與對應(yīng)的癌旁組織相比，MTERF3 mRNA在乳腺癌組織中的表達水平均顯著降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，MTERF2蛋白主要定位于細胞質(zhì)，MTERF2蛋白在乳腺癌組織中的表達量顯著低于對應(yīng)的癌旁組織中的表達量。以上結(jié)果均提示，MTERF2有可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。由于收集到的乳腺癌組織樣本量相對較少，為進一步證實研究結(jié)果的可信性，利用R軟件從TCGA數(shù)據(jù)庫下載整理后完整的707例乳腺癌患者病理資料及其對應(yīng)的MTERF2 mRNA表達量。分析此數(shù)據(jù)集中乳腺癌患者MTERF2 mRNA表達水平與病理參數(shù)特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MTERF2 mRNA表達水平與乳腺癌患者的ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、分子分型、癌癥類型以及組織學(xué)診斷類型存在顯著相關(guān)性 （均P＜0.05），而與患者的年齡、性別、T分期、N分期、M分期、AJCC病理分期、HER2狀態(tài)、以前有無惡性腫瘤發(fā)生以及原發(fā)部位無顯著相關(guān)性（均P＞0.05）。結(jié)果提示，MTERF2 mRNA的表達水平可能與乳腺癌患者的雌激素水平和分子分型存在一定的關(guān)聯(lián)，但與乳腺癌患者的疾病進展無關(guān)。

同時，該研究應(yīng)用Kaplan-Meier模型對預(yù)后相關(guān)數(shù)據(jù)進行生存分析，結(jié)果表明MTERF2 mRNA在乳腺癌中的表達水平與患者的總生存率（OS）以及無病生存率（DFS）無相關(guān)性。為證實研究結(jié)果的可信性，筆者利用Cox比例風(fēng)險回歸模型對乳腺癌中患者的預(yù)后進行單因素分析和多因素分析。在單因素分析中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的年齡、分子分型、T分期、N分期、M分期、AJCC病理分期以及癌癥類型與乳腺癌患者預(yù)后存在顯著相關(guān)（均P＜0.05）。在多因素分析中結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的年齡、M分期以及組織學(xué)診斷類型均是乳腺癌患者預(yù)后的獨立預(yù)后因素（均P＜0.05）。不論在單因素分析還是在多因素分析中，結(jié)果都證實，MTERF2 mRNA的表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后無顯著相關(guān)性。

綜上所述，該研究初步證實，相較于癌旁組織，MTERF2 mRNA和蛋白質(zhì)均在乳腺癌組織中呈低表達，MTERF2的表達水平與乳腺癌患者ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、分子分型、癌癥類型以及組織學(xué)診斷類型存在顯著差異性，提示MTERF2基因可能與乳腺癌的發(fā)生存在一定聯(lián)系，可作為潛在的乳腺癌靶向治療的靶點。然而，MTERF2表達水平與乳腺癌患者的預(yù)后并無相關(guān)性，無法作為分子標(biāo)志物用于對乳腺癌患者的預(yù)后判斷。MTERF2作為一個重要的線粒體轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白質(zhì)，其在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的功能與作用機制仍亟待深入研究。