TGFβ-SMAD通路基因多態(tài)性與鼻咽癌預(yù)后相關(guān)性研究

張 璇，朱海龍，哈敏文

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科(錦州 121000)

鼻咽癌是最為常見的頭頸部惡性腫瘤之一，目前對其治療以放射治療聯(lián)合化療為主[1-3]。鼻咽癌患者治療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率高達(dá)20%～30%[4]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)個體遺傳因素在預(yù)后差異中起著關(guān)鍵作用[5-6]，個體在藥物反應(yīng)、藥物毒性和癌結(jié)局等差異較大[7-8]。單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNP)屬于個體遺傳因素差異的一個重要標(biāo)志，目前有很多研究對單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行了研究，也有許多易感位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)[9]。轉(zhuǎn)化生長因子 β(Transforming growth factor-beta，TGF-β)信號通路與多種惡性腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移有相關(guān)性[10]。本研究分析其與鼻咽癌患者治療后3年轉(zhuǎn)移風(fēng)險的相關(guān)性，為臨床診治提供理論依據(jù)。

對象與方法

1 研究對象 選擇296例鼻咽癌患者為研究對象，296例患者平均年齡(45.12±8.71)歲，其中男性、女性患者分別為214例、82例；臨床分期為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期的患者數(shù)分別為11例、50例、96例、139例；入組條件：經(jīng)病理首次確診的鼻咽癌患者；患者未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；行根治性調(diào)強(qiáng)放射治療者；臨床資料完整者。排除入組前合并其他惡性腫瘤患者。

2 治療方法 I期鼻咽癌患者僅采取放射治療，II期、III期、IV期鼻咽癌患者在化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合放射治療。入組的296例鼻咽癌患者中，接受化療與未接受化療的患者分別為278例、18例，18例未接受化療的患者包含11例I期患者以及7例化療不耐受患者。278例接受化療的鼻咽癌患者包含誘導(dǎo)化療聯(lián)合同步化療聯(lián)合輔助化療患者94例，誘導(dǎo)化療聯(lián)合輔助化療患者40例，誘導(dǎo)化療聯(lián)合同步化療患者84例，單純誘導(dǎo)化療患者40例，單純同步化療患者17例，單純輔助化療3例。

3 SNP位點(diǎn)的選擇 本研究采用Haploview 軟件對美國國家生物技術(shù)信息中心的基因數(shù)據(jù)庫中全部TGF-β/Smad信號通路中主要分子基因的SNP位點(diǎn)進(jìn)行篩選，共選取TGF-β1基因(rs4803455、rs1800469、rs1800470)、TGFβR1基因(rs11568753)、SMAD3基因(rs6494633、rs11071938、rs11632964)、SMAD4基因(rs12958604、rs12456284)、SMAD6基因(rs12913975、rs12906898、rs4776318)，共計(jì)12個SNP位點(diǎn)。

4 基因分型 抽取受試者全血置入肝素抗凝管中，嚴(yán)格按照試劑盒說明提取全血DNA(QIAGEN )并以瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)檢，將合格的DNA樣本保存于-20℃冰箱中備用。本實(shí)驗(yàn)采用Sequenom Mass ARRAY 法對樣本進(jìn)行SNP基因分型。首先通過Sequenom公司的Genotyping tools軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、單堿基延伸反應(yīng)。最后通過基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對樹脂純化后的延伸產(chǎn)物芯片進(jìn)行檢測，以TYPE4.0軟件進(jìn)行分型。

表1 12個SNP位點(diǎn)引物序列

5 隨訪調(diào)查 放療結(jié)束后兩年內(nèi)，門診醫(yī)生進(jìn)行每5個月一次的隨訪；放療結(jié)束后第3～5年進(jìn)行每半年一次的隨訪，放療后5年，進(jìn)行每年一次隨訪。治療后，每半年進(jìn)行一次磁共振檢查(鼻咽、頸部)以及全身放射性骨掃描。

結(jié) 果

1 一般資料、病理學(xué)特征與預(yù)后情況的相關(guān)性分析 296例受試者進(jìn)行隨訪發(fā)現(xiàn)，患者的3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率以及總生存率分別為84.80%(251例)、91.55%(271例)。預(yù)后分析顯示，鼻咽癌患者N分期不同，3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率以及3年總生存率不同(P<0.05)，而患者年齡、性別、T分期、臨床分期、是否接受化療以及化療周期的不同，3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率以及3年總生存率無區(qū)別(P>0.05)。Cox回歸分析結(jié)果顯示，N分期可作為鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存及3年總生存情況的獨(dú)立預(yù)測因素(P<0.05)。綜合預(yù)后分析及Cox回歸分析表明，患者年齡、性別、T分期、化療周期與鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存及3年總生存情況間有關(guān)聯(lián)性(P>0.05)。見表2、3。

2 聯(lián)合分析 同時攜帶三種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率低于同時攜帶1/2種“不利”基因型的患者(P<0.05)。同時攜帶三種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為不攜帶不利基因型患者的5.937倍，同時攜帶兩種“不利”基因型的鼻咽癌患者3年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為不攜帶不利基因型患者的2.469倍。見表4。

3 SNP位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的相關(guān)性分析 單因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)CC基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率低于CT/TT基因型攜帶者(73.85% 與 87.88%)(P<0.05)；TGF-β1基因rs1800470位點(diǎn)CC基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率高于CT/TT基因型攜帶者(87.77% 與 71.64%)(P<0.05)；SMAD4基因rs12958604位點(diǎn)AA基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率高于AG/GG基因型攜帶者(87.93%與 81.67%)(P<0.05)。未見其余SNP 位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況間的相關(guān)性(P>0.05)。多因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)TC/TT基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為CC基因型攜帶者的0.541倍、TGF-β1基因rs1800470位點(diǎn)TC/TT基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為CC基因型攜帶者的2.322倍、SMAD4基因rs12958604位點(diǎn)AG/GG基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為AA基因型攜帶者的2.357倍(P<0.05)。見表5。

表2 鼻咽癌患者一般資料、病理學(xué)特征與預(yù)后分析(n=296)

表3 一般資料、病理學(xué)特征與患者3年無轉(zhuǎn)移生存率及總生存率多因素Cox回歸分析

4 SNP位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年總生存率的相關(guān)性分析 單因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)CC基因型攜帶者3年總生存率低于CT/TT基因型攜帶者(81.54% 與 93.51%)(P<0.05)，未見其余SNP位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年總生存情況間的相關(guān)性(P>0.05)。多因素分析顯示，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)TC/TT基因型攜帶者3年死亡風(fēng)險約為CC基因型攜帶者的0.455倍(P<0.05)。見表6。

表4 不利基因型數(shù)目與3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率Cox 多因素分析

表5 SNP位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存率的相關(guān)性分析

表6 SNP位點(diǎn)基因型與鼻咽癌患者3年總生存率相關(guān)性分析

討 論

鼻咽癌患者的治療方式主要包括使用調(diào)強(qiáng)放射治療以及同步化療[11]，而遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是鼻咽癌患者治療失敗的主要因素[12]。研究人員將鼻咽癌治療的研究重點(diǎn)集中在降低其治療后遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率上[13-14]。隨著研究深入，SNP位點(diǎn)基因型與多種疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)[15]。本研究對鼻咽癌患者TGF-β/Smad 信號通路中的重要基因的12個SNP位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)rs1800470位點(diǎn)TT型基因患者與CT/TT型患者相比，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險要高，這一研究結(jié)果與之前研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)，SMAD4基因rs12958604位點(diǎn)不同基因型鼻咽癌患者3年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中AG/GG基因型攜帶者3年無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險約為AA基因型攜帶者的2.357倍。隨著人們對疾病個體性差異和單核苷酸多態(tài)性的研究不斷深入，很多學(xué)者也發(fā)現(xiàn)鼻咽癌預(yù)后與SNP位點(diǎn)可能有關(guān)聯(lián)性。本研究表明3個SNP位點(diǎn)與鼻咽癌轉(zhuǎn)移風(fēng)險存在相關(guān)性。由于信號通路是十分復(fù)雜的，故而提示僅通過單個SNP位點(diǎn)基因型對預(yù)測預(yù)后的效果可能不佳，而聯(lián)合聯(lián)測同一通路上重要基因的多個SNP位點(diǎn)可能有利于提高預(yù)測能力。本研究發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad信號通路上的多個基因變異有疊加反應(yīng)。另外在臨床上對這種遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險預(yù)測有重要的作用，能夠更好地對高轉(zhuǎn)移風(fēng)險患者進(jìn)行篩查，并及時給予治療來減少遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究平均隨訪時間為39.5個月，而所有患者的3年無轉(zhuǎn)移生存率為84.80%，3年總生存率為91.55%。

綜上所述，鼻咽癌患者中，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)CC 基因型、rs1800470位點(diǎn)TT基因型以及SMAD4基因rs12598604位點(diǎn)AG/GG型攜帶者3年遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險較高，TGF-β1基因rs1800469位點(diǎn)CC基因型攜帶者3年總生存率較低，可通過聯(lián)合分析上述位點(diǎn)對鼻咽癌患者預(yù)后情況進(jìn)行預(yù)測。