周 書,許 勇,赫永金,許迪鋒,方 良,林祖慶
(杭州市大江東醫(yī)院 肝膽胃腸血管外科,浙江 杭州 311225)
肝細胞肝癌為世界范圍內常見的惡性腫瘤之一,位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第5位[1]。多種癌癥基因或抑癌基因的異常表達,在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中起著關鍵作用[2-3]。沉默信號調節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)為新近發(fā)現的一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類組蛋白去乙?;竅4]。在多種成熟組織中表達,胚胎早期即生殖細胞中含量豐富[5-6]。近年來,SIRT1與腫瘤的關系成為腫瘤學研究的熱點問題之一,但在肝細胞肝癌中的作用的相關報道尚不多見。有報道顯示[7-8],惡性腫瘤化療耐藥上SIRT1表現出促進、抑制兩種現象,我們推測SIRT1的過表達在肝細胞肝癌中的耐藥機制中發(fā)揮著重要的作用。基于此,本研究通過探討SIRT1在肝癌組織、細胞中的表達情況,SIRT1過表達與耐藥相關蛋白P-糖蛋白(P-gp)、拓撲異構酶Ⅱα(Top-Ⅱα)的相關性,為臨床合理用藥提供理論指導。
1.1 組織標本 40例新鮮肝癌組織及匹配的癌旁組織取自剛切除的手術標本,手術后即刻投入液氮保存。分別取部分新鮮組織分離組織蛋白、制作免疫組化切片。
1.2 主要試劑與儀器 本研究中使用的主要試劑與儀器見表1。
表1 主要試劑與儀器
1.3 實驗方法
1.3.1 Western-blot 以研磨法勻漿肝癌組織,加400 μL單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織,置于冰上操作。裂解30 min后,將裂解液轉移至1.5 mL EP管中,4℃ 12 000 rpm/min離心5 min,取上清分裝于0.5 mL離心管,-20℃保存。以BCA法檢測蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液,水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓80 V,溴酚藍進入分離膠后調整電壓為120 V繼續(xù)電泳,至溴酚藍遷移至分離膠底部,終止電泳。以4℃,300 mA恒流,70 min,將蛋白轉移至PVDF轉膜上,麗春紅染色觀察轉膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h,洗滌后,滴加兔抗SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα溶液,4℃過夜孵育。第二天加入TBST洗滌去除多余一抗,與HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后,加入ECL化學發(fā)光底物,在化學發(fā)光儀上顯影,拍照保存。
1.3.2 免疫組化 (1)固定、脫水、包埋。取組織放入4%多聚甲醛里面固定3~4 h,取適當大小組織放入包埋盒中,進行脫水。打開包埋機,將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機器組織槽中,進行包埋。(2)切片、制片。打開切片機,固定蠟塊,用力均勻,右手搖動切片,左手用毛筆接片,制片。(3)組織化學染色。60℃干烤2 h脫蠟,二甲苯、梯度酒精、PBS沖洗凈殘余石蠟。以檸檬酸鈉,微波抗原修復,溫度控制在96 ℃~98 ℃。然后將切片放入熱鍋中15 min,最后自然冷卻室溫。以免疫組化筆圈圍住組織,并將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過氧化氫室溫孵育10 min。甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液,放入濕盒內,室溫10 min。滴加一抗蓋住組織,濃度為1∶200,然后放入濕盒內4 ℃過夜。第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復溫30 min,PBS沖洗,甩干水分,滴加二抗,室溫孵育10 min。每張片子滴加50 μL鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗凈后,100 μL DAB溶液,顯微鏡下觀察3~10 min。染色合適即可終止染色,自來水沖洗。蘇木素復染,1~2 min,細胞核變藍色即可終止,0.5%氨水反藍,1%鹽酸酒精分化3 s,自來水沖洗3 min。梯度酒精脫水,涼干片子后滴加適量中性樹膠封片,蓋上蓋玻片,封片,顯微鏡下拍照保存。
免疫組化判斷標準:陽性顯色為不均質棕色顆粒,隨機選擇5個高倍鏡視野,腫瘤細胞染色陽性率≥25%為陽性,陽性染色率<25%為陰性。
1.3.3 細胞培養(yǎng)及蛋白提取 肝癌細胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Huh7均購自中科院上海細胞庫。根據中科院上海細胞庫說明分別選擇DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞密度為整瓶80%~90%時傳代。以Western blot檢測各細胞株中SIRT1相對表達量,選擇相對表達量最高的肝癌細胞株加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑,處理48 h后,以M-PER提取細胞總蛋白。
1.4 統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學軟件為SAS9.3。計量資料的比較采用兩獨立樣本t檢驗,計數資料的比較采用卡方檢驗。連續(xù)變量的相關分析采用Pearson相關分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα在肝癌中表達情況 免疫組織化學結果顯示,SIRT1在40例腫瘤組織中,35例呈陽性表達,陽性表達率87.50%。P-gp在40例腫瘤組織中,33例呈陽性表達,陽性表達率82.50%。Top-Ⅱα在40例腫瘤組織中,8例呈陽性表達,陽性表達率20.00%。腫瘤組織中SIRT1、P-gp陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見封三圖1。
Western blot結果顯示,肝癌組織、癌旁組織中SIRT1灰度值分別為1.25±0.24、0.18±0.05; P-gp灰度值分別為1.16±0.23、0.17±0.06;Top-Ⅱα灰度值分別為0.19±0.08、1.12±0.20。肝癌組織中SIRT1、P-gp相對表達量顯著高于癌旁組織,肝癌組織中Top-Ⅱα相對表達量顯著低于癌旁組織;差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。
圖1 肝癌與癌旁組織中SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα相對表達量
2.2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達的相關性分析 以Western blot檢測的相對表達量數據做相關性分析,SIRT1與P-gp表達量呈正相關(r=0.915,P<0.05),SIRT1與Top-Ⅱα呈負相關(r=-0.906,P<0.05)。見圖2。
2.3 SIRT1在肝癌細胞系中表達情況 在肝癌細胞系中,SMMC-7721中SIRT1相對表達量顯著高于其他肝癌細胞系,其次為Bel7402,再次為MHCC97,再次為HepG2,最后為Huh7;差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。
2.4 SIRT1抑制后P-gp、Top-Ⅱα表達情況 在SMMC-7721細胞中, 加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑Selisistat后,SIRT1、P-gp表達量顯著下降,Top-Ⅱα表達量顯著提高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。
圖2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達量的相關性
圖3 肝癌細胞系中SIRT1相對表達量
圖4 SMMC-7721細胞中給予Selisistat處理對P-gp、Top-Ⅱα表達的影響
SIRT1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要的作用[10-11]。有報道顯示[12-14],SIRT1基因在胃癌、前列腺癌、原發(fā)性結腸癌、急性髓細胞性白血病中均呈高表達,對多種正常生理性過程有著調節(jié)作用,如細胞增殖、炎癥反應、ATP生成、胰島素分泌、尿素循環(huán)等[15-16]。研究表明[17],SIRT1可通過去乙?;揎椊M蛋白,去乙?;疨53、FOXO等非組蛋白及DNA損傷修復蛋白等,參與細胞衰老、腫瘤發(fā)生。也有報道顯示[18],SIRT1在多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)中具有重要的作用,在化療耐藥的腫瘤細胞中SIRT1表達顯著升高。多重耐藥為惡性腫瘤化療中的難點之一,發(fā)生機制復雜,臨床上逆轉途徑小,效果不甚理想。目前的研究發(fā)現[19],多重耐藥主要通過P-gp蛋白/多重耐藥-1基因介導的改變藥物在細胞內聚集,引起細胞內藥物濃度降低、特殊藥物靶點缺失,如Top-Ⅱα表達缺失等?;诖?,我們推測SIRT1在肝癌中的異常表達可能與多重耐藥密切相關。
在肝癌組織中,我們以Western blot及免疫組織化學的方法觀察SIRT1的表達量,結果顯示,SIRT1在40例腫瘤組織中的陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα,為Top-Ⅱα陽性表達率的3.38倍。在肝細胞肝癌細胞系中,5株細胞均有不同程度陽性表達。故我們認為,在人肝癌組織中SIRT1總體表達量較正常組織升高,提示SIRT1可能為一種促癌因子。進一步觀察肝癌組織中耐藥相關蛋白P-gp、Top-Ⅱα的表達情況,結果顯示,P-gp陽性表達率顯著高于Top-Ⅱα,為Top-Ⅱα陽性表達率的3.13倍。Western blot結果也證實,P-gp相對表達量高于Top-Ⅱα。P-gp為ATP依賴的細胞膜轉運體,有MDR1基因編碼,可將細胞毒性物質、各種抗腫瘤藥物排出細胞[19]。Top-Ⅱα為ATP依賴性酶,存在于各種正常分裂的細胞、腫瘤細胞中,在染色體形成、分離、DNA復制等過程中有著重要的作用[20]。既往的研究表明[21],腫瘤細胞內P-gp含量越高,腫瘤對化療的敏感性越低,Top-Ⅱα含量越高對Top-Ⅱα抑制劑敏感性越高,Top-Ⅱα表達下降可導致腫瘤對化療藥物的耐受。這與我們檢測腫瘤組織中P-gp、Top-Ⅱα的表達結論一致,說明肝癌的耐藥機制可能與P-gp、Top-Ⅱα異常表達有關。SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達量的相關性分析結果表明,SIRT1與P-gp表達量呈正相關,SIRT1與Top-Ⅱα呈負相關。提示SIRT1可能參與了P-gp、Top-Ⅱα的異常表達,影響多重耐藥的發(fā)生。為驗證相關性分析的結果,我們選擇在SIRT1表達量最高的SMMC-7721細胞中,給予98 nmol/L的SIRT1特異性抑制劑Selisistat處理,結果顯示,處理后SIRT1、P-gp表達量顯著下降,Top-Ⅱα表達量顯著升高,說明SIRT1可能通過促進P-gp蛋白,降低Top-Ⅱα蛋白表達來促進肝細胞肝癌的多重耐藥[22]。
綜上所述,SIRT1在肝癌組織中表達量高于癌旁組織,SIRT1高表達與耐藥相關蛋白P-gp呈正相關,與Top-Ⅱα呈負相關。SIRT1可能參與肝癌多藥耐藥發(fā)生,可能與調控P-gp、Top-Ⅱα蛋白有關。