周 書(shū),許 勇,赫永金,許迪鋒,方 良,林祖慶
(杭州市大江東醫(yī)院 肝膽胃腸血管外科,浙江 杭州 311225)
肝細(xì)胞肝癌為世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第5位[1]。多種癌癥基因或抑癌基因的異常表達(dá),在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及耐藥中起著關(guān)鍵作用[2-3]。沉默信號(hào)調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)為新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)依賴(lài)煙堿胺腺嘌呤二核苷酸的第Ⅲ類(lèi)組蛋白去乙?;竅4]。在多種成熟組織中表達(dá),胚胎早期即生殖細(xì)胞中含量豐富[5-6]。近年來(lái),SIRT1與腫瘤的關(guān)系成為腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一,但在肝細(xì)胞肝癌中的作用的相關(guān)報(bào)道尚不多見(jiàn)。有報(bào)道顯示[7-8],惡性腫瘤化療耐藥上SIRT1表現(xiàn)出促進(jìn)、抑制兩種現(xiàn)象,我們推測(cè)SIRT1的過(guò)表達(dá)在肝細(xì)胞肝癌中的耐藥機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用?;诖?,本研究通過(guò)探討SIRT1在肝癌組織、細(xì)胞中的表達(dá)情況,SIRT1過(guò)表達(dá)與耐藥相關(guān)蛋白P-糖蛋白(P-gp)、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα(Top-Ⅱα)的相關(guān)性,為臨床合理用藥提供理論指導(dǎo)。
1.1 組織標(biāo)本 40例新鮮肝癌組織及匹配的癌旁組織取自剛切除的手術(shù)標(biāo)本,手術(shù)后即刻投入液氮保存。分別取部分新鮮組織分離組織蛋白、制作免疫組化切片。
1.2 主要試劑與儀器 本研究中使用的主要試劑與儀器見(jiàn)表1。
表1 主要試劑與儀器
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 Western-blot 以研磨法勻漿肝癌組織,加400 μL單混有蛋白酶抑制劑的去污劑裂解液裂解組織,置于冰上操作。裂解30 min后,將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中,4℃ 12 000 rpm/min離心5 min,取上清分裝于0.5 mL離心管,-20℃保存。以BCA法檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品加10×上樣緩沖液,水浴煮沸5 min。以每孔30 μg蛋白的上樣量行聚丙烯酰胺凝膠電泳,恒壓80 V,溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠后調(diào)整電壓為120 V繼續(xù)電泳,至溴酚藍(lán)遷移至分離膠底部,終止電泳。以4℃,300 mA恒流,70 min,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF轉(zhuǎn)膜上,麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)膜效果。5%BSA封閉PVDF膜2 h,洗滌后,滴加兔抗SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα溶液,4℃過(guò)夜孵育。第二天加入TBST洗滌去除多余一抗,與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h。TBST清洗后,加入ECL化學(xué)發(fā)光底物,在化學(xué)發(fā)光儀上顯影,拍照保存。
1.3.2 免疫組化 (1)固定、脫水、包埋。取組織放入4%多聚甲醛里面固定3~4 h,取適當(dāng)大小組織放入包埋盒中,進(jìn)行脫水。打開(kāi)包埋機(jī),將脫水后的組織連同包埋盒依次放入機(jī)器組織槽中,進(jìn)行包埋。(2)切片、制片。打開(kāi)切片機(jī),固定蠟塊,用力均勻,右手搖動(dòng)切片,左手用毛筆接片,制片。(3)組織化學(xué)染色。60℃干烤2 h脫蠟,二甲苯、梯度酒精、PBS沖洗凈殘余石蠟。以檸檬酸鈉,微波抗原修復(fù),溫度控制在96 ℃~98 ℃。然后將切片放入熱鍋中15 min,最后自然冷卻室溫。以免疫組化筆圈圍住組織,并將切片放入濕盒中,盒中加入少量蒸餾水,滴加3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min。甩干水分,吸干水珠,加山羊血清封閉液,放入濕盒內(nèi),室溫10 min。滴加一抗蓋住組織,濃度為1∶200,然后放入濕盒內(nèi)4 ℃過(guò)夜。第二天,4度冰箱取出濕盒,室溫復(fù)溫30 min,PBS沖洗,甩干水分,滴加二抗,室溫孵育10 min。每張片子滴加50 μL鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化物酶溶液,室溫孵育10 min,PBS沖洗凈后,100 μL DAB溶液,顯微鏡下觀察3~10 min。染色合適即可終止染色,自來(lái)水沖洗。蘇木素復(fù)染,1~2 min,細(xì)胞核變藍(lán)色即可終止,0.5%氨水反藍(lán),1%鹽酸酒精分化3 s,自來(lái)水沖洗3 min。梯度酒精脫水,涼干片子后滴加適量中性樹(shù)膠封片,蓋上蓋玻片,封片,顯微鏡下拍照保存。
免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn):陽(yáng)性顯色為不均質(zhì)棕色顆粒,隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野,腫瘤細(xì)胞染色陽(yáng)性率≥25%為陽(yáng)性,陽(yáng)性染色率<25%為陰性。
1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及蛋白提取 肝癌細(xì)胞系SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Huh7均購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。根據(jù)中科院上海細(xì)胞庫(kù)說(shuō)明分別選擇DMEM培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基,在37℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度為整瓶80%~90%時(shí)傳代。以Western blot檢測(cè)各細(xì)胞株中SIRT1相對(duì)表達(dá)量,選擇相對(duì)表達(dá)量最高的肝癌細(xì)胞株加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑,處理48 h后,以M-PER提取細(xì)胞總蛋白。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SAS9.3。計(jì)量資料的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料的比較采用卡方檢驗(yàn)。連續(xù)變量的相關(guān)分析采用Pearson相關(guān)分析。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα在肝癌中表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,SIRT1在40例腫瘤組織中,35例呈陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率87.50%。P-gp在40例腫瘤組織中,33例呈陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率82.50%。Top-Ⅱα在40例腫瘤組織中,8例呈陽(yáng)性表達(dá),陽(yáng)性表達(dá)率20.00%。腫瘤組織中SIRT1、P-gp陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)封三圖1。
Western blot結(jié)果顯示,肝癌組織、癌旁組織中SIRT1灰度值分別為1.25±0.24、0.18±0.05; P-gp灰度值分別為1.16±0.23、0.17±0.06;Top-Ⅱα灰度值分別為0.19±0.08、1.12±0.20。肝癌組織中SIRT1、P-gp相對(duì)表達(dá)量顯著高于癌旁組織,肝癌組織中Top-Ⅱα相對(duì)表達(dá)量顯著低于癌旁組織;差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。
圖1 肝癌與癌旁組織中SIRT1、P-gp、Top-Ⅱα相對(duì)表達(dá)量
2.2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)的相關(guān)性分析 以Western blot檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析,SIRT1與P-gp表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.915,P<0.05),SIRT1與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)(r=-0.906,P<0.05)。見(jiàn)圖2。
2.3 SIRT1在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)情況 在肝癌細(xì)胞系中,SMMC-7721中SIRT1相對(duì)表達(dá)量顯著高于其他肝癌細(xì)胞系,其次為Bel7402,再次為MHCC97,再次為HepG2,最后為Huh7;差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。
2.4 SIRT1抑制后P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)情況 在SMMC-7721細(xì)胞中, 加入使用濃度為98 nmol/L的SIRT1抑制劑Selisistat后,SIRT1、P-gp表達(dá)量顯著下降,Top-Ⅱα表達(dá)量顯著提高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。
圖2 SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)量的相關(guān)性
圖3 肝癌細(xì)胞系中SIRT1相對(duì)表達(dá)量
圖4 SMMC-7721細(xì)胞中給予Selisistat處理對(duì)P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)的影響
SIRT1在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有著重要的作用[10-11]。有報(bào)道顯示[12-14],SIRT1基因在胃癌、前列腺癌、原發(fā)性結(jié)腸癌、急性髓細(xì)胞性白血病中均呈高表達(dá),對(duì)多種正常生理性過(guò)程有著調(diào)節(jié)作用,如細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、ATP生成、胰島素分泌、尿素循環(huán)等[15-16]。研究表明[17],SIRT1可通過(guò)去乙酰化修飾組蛋白,去乙酰化P53、FOXO等非組蛋白及DNA損傷修復(fù)蛋白等,參與細(xì)胞衰老、腫瘤發(fā)生。也有報(bào)道顯示[18],SIRT1在多重耐藥(multi-drug resistance, MDR)中具有重要的作用,在化療耐藥的腫瘤細(xì)胞中SIRT1表達(dá)顯著升高。多重耐藥為惡性腫瘤化療中的難點(diǎn)之一,發(fā)生機(jī)制復(fù)雜,臨床上逆轉(zhuǎn)途徑小,效果不甚理想。目前的研究發(fā)現(xiàn)[19],多重耐藥主要通過(guò)P-gp蛋白/多重耐藥-1基因介導(dǎo)的改變藥物在細(xì)胞內(nèi)聚集,引起細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低、特殊藥物靶點(diǎn)缺失,如Top-Ⅱα表達(dá)缺失等。基于此,我們推測(cè)SIRT1在肝癌中的異常表達(dá)可能與多重耐藥密切相關(guān)。
在肝癌組織中,我們以Western blot及免疫組織化學(xué)的方法觀察SIRT1的表達(dá)量,結(jié)果顯示,SIRT1在40例腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα,為T(mén)op-Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率的3.38倍。在肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系中,5株細(xì)胞均有不同程度陽(yáng)性表達(dá)。故我們認(rèn)為,在人肝癌組織中SIRT1總體表達(dá)量較正常組織升高,提示SIRT1可能為一種促癌因子。進(jìn)一步觀察肝癌組織中耐藥相關(guān)蛋白P-gp、Top-Ⅱα的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,P-gp陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于Top-Ⅱα,為T(mén)op-Ⅱα陽(yáng)性表達(dá)率的3.13倍。Western blot結(jié)果也證實(shí),P-gp相對(duì)表達(dá)量高于Top-Ⅱα。P-gp為ATP依賴(lài)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體,有MDR1基因編碼,可將細(xì)胞毒性物質(zhì)、各種抗腫瘤藥物排出細(xì)胞[19]。Top-Ⅱα為ATP依賴(lài)性酶,存在于各種正常分裂的細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞中,在染色體形成、分離、DNA復(fù)制等過(guò)程中有著重要的作用[20]。既往的研究表明[21],腫瘤細(xì)胞內(nèi)P-gp含量越高,腫瘤對(duì)化療的敏感性越低,Top-Ⅱα含量越高對(duì)Top-Ⅱα抑制劑敏感性越高,Top-Ⅱα表達(dá)下降可導(dǎo)致腫瘤對(duì)化療藥物的耐受。這與我們檢測(cè)腫瘤組織中P-gp、Top-Ⅱα的表達(dá)結(jié)論一致,說(shuō)明肝癌的耐藥機(jī)制可能與P-gp、Top-Ⅱα異常表達(dá)有關(guān)。SIRT1與P-gp、Top-Ⅱα表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明,SIRT1與P-gp表達(dá)量呈正相關(guān),SIRT1與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)。提示SIRT1可能參與了P-gp、Top-Ⅱα的異常表達(dá),影響多重耐藥的發(fā)生。為驗(yàn)證相關(guān)性分析的結(jié)果,我們選擇在SIRT1表達(dá)量最高的SMMC-7721細(xì)胞中,給予98 nmol/L的SIRT1特異性抑制劑Selisistat處理,結(jié)果顯示,處理后SIRT1、P-gp表達(dá)量顯著下降,Top-Ⅱα表達(dá)量顯著升高,說(shuō)明SIRT1可能通過(guò)促進(jìn)P-gp蛋白,降低Top-Ⅱα蛋白表達(dá)來(lái)促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的多重耐藥[22]。
綜上所述,SIRT1在肝癌組織中表達(dá)量高于癌旁組織,SIRT1高表達(dá)與耐藥相關(guān)蛋白P-gp呈正相關(guān),與Top-Ⅱα呈負(fù)相關(guān)。SIRT1可能參與肝癌多藥耐藥發(fā)生,可能與調(diào)控P-gp、Top-Ⅱα蛋白有關(guān)。