肉毒毒素的研發(fā)及應用進展

靳令經(jīng)， 潘麗珍

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200065)

肉毒毒素(botulinum toxin， BT)是由肉毒梭狀芽孢桿菌在缺氧條件下產(chǎn)生的一種細菌外毒素，屬于神經(jīng)毒素，是已知最致命的物質(zhì)之一。20世紀80年代，BT治療斜視獲得成功。近40年來，隨著對其作用機制的深入了解以及對其生物學效應的精準把握，BT的臨床應用領域不斷拓展。目前，BT已成功應用于神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、美容整形、康復醫(yī)學等多種領域，并正嘗試用于頑固性疼痛、腺體過度分泌、雷諾綜合征、抑郁癥等病癥的治療。與此同時，不斷有新型BT藥物研發(fā)成功，為臨床提供了多元化、個體化的選擇。

1 肉毒毒素的結(jié)構(gòu)及作用機制

1.1 BT的結(jié)構(gòu)及分型

BT主要由肉毒神經(jīng)毒素(botulinum neurotoxin， BoNT)及輔助蛋白(complexing proteins， CP)組成。BoNT相對分子質(zhì)量為150000，由相對分子質(zhì)量為50000的輕鏈(light chain， LC)及相對分子質(zhì)量為100000的重鏈(heavy chain， HC)通過二硫鍵連接，成為有活性的雙鏈。所有血清型BoNT都具有3個相對分子質(zhì)量基本相同但功能不同的區(qū)域： HC的氨基端(相對分子質(zhì)量為50000，HN)為易位區(qū)，HC的羧基端(相對分子質(zhì)量為50000，HC)為受體結(jié)合區(qū)，LC為催化區(qū)域。CP主要由非毒素非血凝素(non-toxic non-hemagglutinin， NTNHA)及血凝素(hemagglutinin， HA)兩部分構(gòu)成[1-2]。BoNT是BT的活性成分。在BT自然口服條件下，CP可保護BoNT通過胃腸道的酸性環(huán)境并與腸道黏膜結(jié)合，進入生物體內(nèi)。在臨床注射途徑下，在BT到達靶組織神經(jīng)末梢突觸前膜前，BoNT已經(jīng)從復合物中解離，CP不僅無法發(fā)揮自然條件下的保護作用，反而存在刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗體的風險[3]。

根據(jù)抗原性不同，BT分為不同血清型。目前已確認并廣泛接受的自然產(chǎn)生的BT共有7種，按照字母順序命名為BT/A～BT/G。2014年，曾有研究報道第8種血清型H(BT/H)[4]，但近期研究表明其與BT/A及BT/F有類似的結(jié)構(gòu)并與BT/A具有相似的抗原性，故將其命名為BT/FA或BT/HA[5]。2017年，Zhang等[6]采用GenBank數(shù)據(jù)中肉毒桿菌菌株111的基因序列，通過基因組測序及生物信息學技術(shù)，得到一種新型BT蛋白序列，并與目前已知的BT無相同抗原性，暫時將其命名為BT/X，目前尚不清楚該菌株在自然條件下是否產(chǎn)生BT/X。每種血清型根據(jù)氨基酸序列的不同又分為不同的亞型。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40余種不同的BT亞型。目前以BT/A應用范圍最廣。

1.2 BT的作用機制

BoNT通過HC受體結(jié)合區(qū)域與神經(jīng)末梢特異性受體結(jié)合，形成內(nèi)吞小體進入神經(jīng)末梢胞質(zhì)。內(nèi)吞小體在ATP酶的作用下，易位區(qū)插入脂質(zhì)雙分子層形成細小通道，催化區(qū)即LC通過此通道進入神經(jīng)末梢細胞質(zhì)內(nèi)。LC是一種鋅鈦鏈內(nèi)切酶，可以水解可溶性N-乙基馬來酰胺-敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethyl-maleimide-sensitive factor attachment protein receptor， SNARE)復合體，影響突觸囊泡與突觸前膜融合及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。

SNARE蛋白復合體是囊泡膜與神經(jīng)末梢細胞膜結(jié)合的必要成分，包含3種蛋白： 突觸相關膜蛋白(VAMP)、突觸融合蛋白(syntaxin)和突觸小體相關蛋白25(SNAP-25)。不同血清型的毒素，其水解的目標蛋白及位點亦不相同：
A、E型作用于SNAP-25，B、D、G、F型水解VAMP，C型可水解Syntaxin和SNAP-25。其中BoNT/A于SNAP-25 C端移除9個氨基酸殘基，形成SNAP-251-197，而BoNT/E移除26個氨基酸殘基形成SNAP-251-180。這些蛋白一旦被BoNT水解，含有乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)囊泡的釋放將受到抑制，導致神經(jīng)-肌肉信號傳遞障礙，達到化學性去神經(jīng)支配的作用，引起骨骼肌遲緩性癱瘓及自主神經(jīng)功能障礙。

盡管BT作用于神經(jīng)末梢抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，但并未破壞神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)及生理功能，隨著神經(jīng)末梢功能的逐漸恢復，其導致的神經(jīng)癱瘓作用完全可逆。由于不同血清型BT在神經(jīng)末梢所結(jié)合的特異性受體不同，水解的目標蛋白及位點不同，LC在細胞內(nèi)被清除的時間不同，不同血清型的BT作用時間亦不盡相同。作用時間長短順序為BT/A、BT/C、BT/B、BT/D、BT/F、BT/G、BT/E。在人類骨骼肌中，作用時間最長的BT/A為3～6個月；最短的為BT/E，作用時間<4周[7]。

1.3 BT的中樞作用及逆向轉(zhuǎn)運

目前已經(jīng)證實并被廣泛接受的是： BT藥物有效的治療效果基于其對注射部位神經(jīng)末梢遞質(zhì)釋放的特異性高效抑制。但越來越多的研究表明BT對周圍神經(jīng)的作用難以解釋所有的臨床現(xiàn)象，提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)參與其中的可能。通過功能磁共振研究發(fā)現(xiàn)，卒中后偏側(cè)肢體痙攣的患者，BT注射后其同側(cè)及對側(cè)大腦運動皮層活動減少，而且在運動皮層以外其他腦區(qū)如頂葉、枕葉皮層或小腦的區(qū)域激活模式亦有變化[8-9]；頸部肌張力障礙患者BT局部注射后，頭顱磁共振可顯示大腦皮層灰質(zhì)信號及體積的改變，提示外周注射BT對大腦皮層結(jié)構(gòu)及功能產(chǎn)生影響[10]。單側(cè)眼輪匝肌、甲杓肌注射可引起對側(cè)相應肌肉電生理信號的變化[11-12]；另外比目魚肌注射可導致同側(cè)遠隔非注射肌肉股四頭肌電生理信號改變[13]，提示局部肌內(nèi)注射BT后可影響脊髓、腦干神經(jīng)元功能。在含BT的孵育液細胞中可觀測到BT的逆軸突運輸；在動物實驗中，局部注射BT后，可在腦干組織中發(fā)現(xiàn)被水解的SNAP-25[14-15]，提示BT或被水解的SNAP-25逆軸突轉(zhuǎn)運的可能。但也有部分研究結(jié)果與此并不一致[16]，并且目前尚無直接證據(jù)表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能的改變與逆向軸突運輸相關，或者與其注射后神經(jīng)環(huán)路信號改變相關。BT對中樞的作用機制尚需進一步研究。

1.4 BT的免疫原性

BT中的BoNT及CP成分注射入人體后，作為異源性蛋白可刺激機體產(chǎn)生抗體。直接作用于BoNT成分并導致BT作用效能下降的抗體，被稱為中和性抗體，可導致繼發(fā)性治療無應答；針對CP及其他非BoNT成分產(chǎn)生的抗體，被稱為非中和性抗體，不影響B(tài)oNT的治療效果，但可增加中和性抗體產(chǎn)生的風險[17]。

盡管目前臨床中BT應用非常廣泛，但其產(chǎn)生抗體并導致繼發(fā)性無應答的概率很低。BT/B型藥物由于注射劑量高于BT/A型，其產(chǎn)生抗體的可能性高于后者。目前報道BT/A產(chǎn)生抗體的概率為0%～3%，BT/B產(chǎn)生抗體的概率為10%～44%[18-19]。對BT/A產(chǎn)生繼發(fā)性無應答的患者可給予BT/B型藥物治療。

2 基于作用機制的新型藥物的研發(fā)

2.1 BT臨床藥物現(xiàn)狀

1989年，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)首次批準BT藥物——onabotulinumtoxinA(Botox?, 愛爾蘭Allergan公司)上市，以后陸續(xù)有新的藥物進入臨床應用。目前有BT/A及BT/B被FDA批準作為藥物應用于臨床，其中BT/A除onabotulinumtoxinA外，還包括： abobotulinumtoxinA(Dysport?,法國Ipsen公司)及incobotulinumtoxinA(Xeomin?,德國Merz公司)，BT/B型藥物有rimabotulinumtoxinB(Myobloc?,美國Solstice Neurosciences公司)。另外，我國自主研發(fā)生產(chǎn)的衡力?(lanbotulinumtoxinA，Lantox?，中國蘭州生物制品研究所)在亞洲、拉丁美洲及東歐等地區(qū)的多個國家注冊應用。我國目前僅有Botox?及Lantox?被批準用于臨床。在臨床使用的藥物中，其組成除了BoNT及CP以外，還有與藥物穩(wěn)定性有關的賦形劑。不同產(chǎn)品賦形劑不同，如Botox?為人血白蛋白，Lanlox?為明膠。在隨著對BT結(jié)構(gòu)及作用機制研究的進一步深入，不同血清型、亞型及不同藥物輔助成分的BT逐漸被研發(fā)，為臨床提供更豐富的選擇。

2.2 不同藥物成分改變藥物作用特征

IncobotulinumtoxinA僅含有BoNT活性成分而不含有CP，自2005年上市以來已在歐美國家得以廣泛應用。其與onabotulinumtoxinA具有同等的臨床療效。而且由于無CP成分而降低了免疫原性，可減少繼發(fā)性無應答的產(chǎn)生[20]。我國蘭州生物制品研究所已研發(fā)出不含CP成分的BoNT/A——chinbotulinumtoxin。

另外一種正在研發(fā)的針對BT/A的藥物daxi-botulinumtoxinA(RT002)，亦是純化的BoNT，在凍干粉藥物中含有專用的穩(wěn)定輔料肽(RTP004)，不含CP及白蛋白或其他人或動物的血液成分，具有更高的穩(wěn)定性及更低的免疫原性。Ⅱ期臨床研究亦顯示，daxibotulinumtoxinA在頸部肌張力障礙及眉間紋治療中具有良好的耐受性及較長的作用時間[21-22]。

2.3 多種血清型藥物的研發(fā)

BT/E與BT/A一樣作用于SNAP-25，但BT/E與BT/A結(jié)合神經(jīng)末梢的特異性受體不同，作用于SNAP-25的位點不同，其起效時間更快，作用時間更短。目前，新型BT/E型藥物及重組BT/E藥物正在研發(fā)，并且已分別進入Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗階段。其將應用于僅需要短期治療效果的疾病，如骨折骨關節(jié)脫位后及術(shù)后瘢痕預防中期望短期抑制肌肉收縮時。

3 基于作用機制的臨床應用拓展

3.1 BT藥物的臨床應用現(xiàn)狀

目前，BT已廣泛應用于臨床疾病治療及醫(yī)學美容領域，適應證超過30個。2008年，美國神經(jīng)病學會(American Academic of Neurology， AAN)發(fā)布了關于運動障礙、自主神經(jīng)功能障礙、疼痛以及痙攣狀態(tài)的BT治療指南，通過對各項基于循證醫(yī)學報道的證據(jù)進行分級及綜合分析，形成各適應證的治療推薦建議。2016年，AAN更新了BT/A在面肌痙攣、頸部肌張力障礙、成人痙攣狀態(tài)及頭痛的治療指南及推薦級別，并首次對不同品牌的BT/A分別進行推薦，指導臨床醫(yī)生在準確評估的情況下進行超適應證治療[23]。

在神經(jīng)病學領域，BT用于治療： (1) 肌張力障礙，尤其是局灶性肌張力障礙如眼瞼痙攣、頸部肌張力障礙的一線治療。(2) 非肌張力障礙性運動障礙，如偏側(cè)面積痙攣、震顫、抽動癥及磨牙癥等。(3) 痙攣狀態(tài)，如腦卒中、脊髓損傷及多發(fā)性硬化等疾病導致的痙攣狀態(tài)，亦包括小兒腦癱。在眼科用于斜視的治療；在自主神經(jīng)功能障礙領域，用于治療多汗、流涎等；在泌尿?qū)W領域，BT局部注射用于神經(jīng)源性逼尿肌過度活動癥、膀胱過度活動癥及逼尿肌-括約肌功能失調(diào)等；在疼痛治療方面，慢性偏頭痛已成為FDA批準的BT治療適應證；在醫(yī)學美容領域，用于減輕魚尾紋、眉間紋及動力性額前紋等，也用于改善下面部皺紋及頸紋。

2018年，我國肉毒毒素治療應用專家組及中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會帕金森病及運動障礙學組以國際BT/A臨床應用的循證醫(yī)學證據(jù)為基礎，參考AAN的適應證推薦分級，結(jié)合中國專家長期應用肉毒毒素的治療經(jīng)驗，共同制定了《中國肉毒毒素治療應用專家共識》[24]。在此版本中，BT的適應證及推薦級別如表1。

表1 肉毒毒素的臨床適應證及推薦級別

3.2 不斷拓展的臨床應用領域

在自主神經(jīng)功能疾病治療領域，除多汗、流涎等病癥以外，有小樣本研究顯示BT局部注射對雷諾綜合征治療安全有效[25]。其機制可能與其抑制去甲腎上腺素的釋放，調(diào)節(jié)血管平滑肌功能有關[26]。目前，同濟大學附屬同濟醫(yī)院正在進行一項單中心的隨機雙盲安慰劑對照研究(ChiCTR-1800015359)，以期獲得更多循證醫(yī)學證據(jù)。

慢性疼痛是臨床工作中常見的一種綜合征，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。BT治療緩解疼痛的最初證據(jù)來源于在治療肌肉過度緊張相關的疾病如肌張力障礙或痙攣狀態(tài)時，其伴發(fā)的疼痛緩解。雖然肌肉松弛可能在一些情況下發(fā)揮作用，但越來越多的證據(jù)表明，它們不能解釋BT治療后緩解疼痛的所有機制。例如，在肌內(nèi)注射BT的情況下，緩解疼痛的作用也可以先于肌肉松弛作用或持續(xù)更長時間。目前普遍認為，除了局部去神經(jīng)支配以外，其軸突逆向運輸或中樞作用也可能參與其中，但具體作用機制尚需進一步研究。

對慢性偏頭痛，除了可預防偏頭痛發(fā)作，減輕發(fā)作程度，長期治療亦可明顯改善患者的生活質(zhì)量并且耐受性良好[27]。但對臨床常見的緊張性頭痛，基于目前開放性研究及隨機雙盲對照研究結(jié)果，并不推薦BT局部注射[23]。BT被嘗試用于神經(jīng)病理性疼痛如皰疹后神經(jīng)痛、三叉神經(jīng)痛、幻肢痛及糖尿病周圍神經(jīng)病等的治療，小樣本研究治療有效[28]，尤其對高齡難治性三叉神經(jīng)痛患者是良好的選擇[29]。另外，對于慢性骨筋膜疼痛患者，BT治療能夠緩解疼痛癥狀，改善生活質(zhì)量。

骨關節(jié)炎及相關性關節(jié)疼痛同樣影響患者的生活質(zhì)量，臨床治療目標是緩解疼痛及減少關節(jié)功能損傷。目前有限的臨床研究采用安慰劑對照顯示，膝關節(jié)內(nèi)注射BT后評估疼痛緩解情況及關節(jié)功能改變的結(jié)果并不一致[30-31]。其治療效果及作用機制有待于更多的循證醫(yī)學研究。

在創(chuàng)傷修復過程中，局部組織代謝活動增加并伴發(fā)局部炎癥反應，可導致創(chuàng)口邊緣肌肉收縮，影響創(chuàng)面愈合并形成瘢痕。鑒于BT化學性去神經(jīng)支配作用，通過在傷口附近局部注射BT，有助于傷口的整體愈合過程和改善愈合傷口的外觀[32-33]。新型BT/E藥物的研發(fā)，將更有利于該領域的應用。

此外，在其他領域，如賁門失弛緩癥、糖尿病性胃癱、前列腺增生、間質(zhì)性膀胱炎等，BT均可改善患者癥狀；對抑郁癥患者進行皺眉肌區(qū)域注射亦能取得良好治療效果。這些僅限于小樣本的臨床實驗或病例報道，為將來BT的應用提供更多的思路或可能。

4 展 望

BT是一種特異、高效的治療性蛋白質(zhì)，通過抑制神經(jīng)肌肉及腺體的過度活躍而達到緩解癥狀的目的。隨著生物學、基因組學、蛋白質(zhì)組學等技術(shù)的進展，越來越多的BT被逐漸發(fā)現(xiàn)及利用，人們對其結(jié)構(gòu)及作用機制的研究及認識將更加深入，從而為新型藥物的研發(fā)提供基礎。此外，在未來幾年中，修飾和重組毒素將進一步擴展BT的應用前景。臨床研究的快速發(fā)展及評估治療手段的更加精準化，將有助于提高BT療效，減少副反應發(fā)生，進一步拓展其臨床應用范圍，為更多的患者提供有效的、個體化的治療。