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    1型糖尿病大鼠外周5-HT水平下降與結(jié)腸動力障礙的相關(guān)性研究

    2019-11-13 08:10:40成穎瑩戎偉芳張國花
    關(guān)鍵詞:外源性結(jié)腸動力

    成穎瑩, 王 娟, 戎偉芳, 張國花

    (上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)與生理學(xué)系,上海 200025)

    糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病,1型糖尿病患者胃腸道并發(fā)癥比較常見,如胃輕癱、腸道動力異常等[1]。由腸嗜鉻細胞合成并分泌的5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)參與調(diào)節(jié)腸道運動、腸神經(jīng)發(fā)生、上皮細胞的分泌及血管的舒張,同時參與黏膜的生長維持與機體的炎癥反應(yīng)[2]。有研究表明5-HT參與糖尿病血糖和胰島素分泌的調(diào)節(jié)[3],5-HT4受體激動劑可以改善糖尿病小鼠胃輕癱[4]。本研究旨在研究結(jié)腸及血液中5-HT在1型糖尿病發(fā)展過程中的變化特點及外源性給予5-HT對糖尿病大鼠血糖和結(jié)腸運輸功能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    SD雄性大鼠46只,體質(zhì)量200~220g,2月齡,由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供,自由進食飲水,恒溫25℃。

    1.2 試劑與儀器

    1.2.1 主要藥品與試劑 鏈脲佐菌素(streptozo-tocin, STZ)、5-HT、洋紅(carmine)購自Sigma公司;羊抗5-HT抗體購自Neuromics公司;Alexa fluro 568標(biāo)記的驢抗羊二抗購自Invitrogen公司;BCA蛋白測定試劑盒、增強型顯影液購自Thermo Scientific公司;預(yù)染蛋白marker、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購自Bio-rad公司;兔抗色氨酸羥化酶(TPH1)抗體購自Millipore公司;鼠抗β-actin購自Bioworld公司。

    1.2.2 主要儀器 羅康全活力型血糖儀購自德國羅氏診斷有限公司;冰凍切片機、熒光倒置顯微鏡購自德國Leica公司;Ultimate 3000 UHPLC高效液相色譜系統(tǒng)購自Dionex公司;冷凍離心機、TSQ Vantage三重四級桿質(zhì)譜儀系統(tǒng)購自Thermo Scientific公司;顯影儀ImageQuant LAS 4000購自GE公司。

    1.3 方法

    1.3.1 大鼠1型糖尿病模型的建立 采用腹腔注射STZ建立大鼠1型糖尿病模型。將STZ溶解于0.01mol/L冰冷的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH=4.0),腹腔注射給藥(50mg/kg),對照組腹腔注射等體積的緩沖溶液。3d后檢測血糖濃度,選取血糖濃度≥15mmol/L的大鼠(模型建立成功)進行后續(xù)實驗。模型建立過程中,持續(xù)觀測動物的體質(zhì)量和血糖情況。

    1.3.2 免疫熒光組織化學(xué) 為了研究1型糖尿病進程中結(jié)腸5-HT表達變化特點,利用免疫熒光方法檢測5-HT免疫陽性細胞的數(shù)目變化。用冰凍切片機將固定并包埋好的結(jié)腸組織塊切片,15μm厚,貼片于載玻片上。用含10%正常驢血清的1% PBST在室溫下封閉1h;一抗為羊抗5-HT(1∶1000)室溫孵育4h后4℃孵育過夜,陰性對照的一抗用1% PBST代替。用Alexa fluro 568標(biāo)記的驢抗羊(1∶1000)和DAPI(1∶1000)常溫下孵育1h。0.05mol/L PBS清洗后用封片劑封片。使用熒光顯微鏡拍照,每只動物隨機選取4~6個視野,并計數(shù)免疫陽性表達細胞。

    1.3.3 高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)檢測大鼠血清中5-HT含量 大鼠麻醉后用膠帶仰臥位固定在木板上,打開胸腔暴露心臟,用1mL注射器吸取左心室動脈血500~1000μL,轉(zhuǎn)移到1.5mL EP管中,4℃靜置過夜。第2天,常溫下5000×g,離心10min后取上清液,用HPLC-MS檢測血清中5-HT的含量,測得的5-HT濃度單位為ng/mL。

    1.3.4 Western印跡法 為了進一步明確在糖尿病發(fā)展進程中,外周5-HT含量的減少是否與其合成速率下降有關(guān),采用Western印跡法檢測結(jié)腸黏膜組織中5-HT合成的限速酶TPH1的蛋白表達水平。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(80mg/kg)溶液麻醉大鼠,暴露腹腔,剪取1cm左右的結(jié)腸,用眼科剪小心地沿腸系膜中線將所取腸段剪開,黏膜層朝上鋪平在載玻片上,在組織的一側(cè)用刀片劃出切口,隨后用細胞刮板從切口處開始均勻用力,將結(jié)腸上層的全部黏膜層組織刮下來。組織經(jīng)裂解液裂解蛋白,BCA法測定蛋白濃度。每組取30μg蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,PVDF膜轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉2h,一抗為兔抗TPH1抗體孵育4℃過夜,使用HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗常溫下孵育2h,在成像系統(tǒng)上進行曝光并記錄。

    1.3.5 外源性5-HT的給藥方案 根據(jù)5-HT在1型糖尿病進程中的變化特點,在糖尿病模型建立兩周后,腹腔注射5-HT(10mg/kg,溶解于0.9% NaCl),隔天1次,共6次[5],對照組注射同體積溶劑,第6次注射后1d進行大鼠結(jié)腸動力行為學(xué)測定。

    1.3.6 大鼠結(jié)腸動力行為學(xué)測定 在結(jié)腸動力行為學(xué)測定前1周內(nèi)對各組大鼠進行結(jié)腸置管手術(shù)[6]。主要將聚乙烯PE10導(dǎo)管距盲腸2cm處置于結(jié)腸內(nèi)2.5cm,導(dǎo)管另一端沿皮下穿出固定于頸部皮膚。大鼠結(jié)腸置管術(shù)后約5d進行結(jié)腸動力學(xué)行為檢測。實驗時向?qū)Ч苤凶⑷胄迈r配置的洋紅-纖維素溶液(6%,0.5mL),隨后持續(xù)觀察10h,記錄帶有紅色染料糞便的排出時間,計算非糖尿病組均值,并將所有數(shù)值與均值進行對比,比較各組之間的相對變化。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 糖尿病模型大鼠結(jié)腸及血清內(nèi)5-HT的含量減少

    免疫組化方法檢測結(jié)果顯示,結(jié)腸組織中5-HT的表達隨著糖尿病的進程呈進行性下降,具有時間依賴性: 5-HT免疫陽性反應(yīng)的細胞主要分布在黏膜層,可能主要是上皮腸嗜鉻細胞和固有層中肥大細胞[7]。與非糖尿病組相比,糖尿病模型建立后1、2和4周,黏膜層上皮和固有層中5-HT陽性表達細胞的數(shù)量均出現(xiàn)顯著性減少(P=0.0003,P=0.002,P<0.0001),見圖1A、圖1B。利用HPLC-MS方法檢測發(fā)現(xiàn)與非糖尿病組相比,STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠血清中的5-HT濃度在模型建立后3~4周時出現(xiàn)明顯降低(P=0.002,P=0.0009),見圖1C。

    圖1 STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠外周5-HT含量下降Fig.1 The decrease of peripheral 5-HT level in SYZ-induced type 1 diabetic rats.A、B: 結(jié)腸5-HT免疫熒光染色的變化;與ND組比較,D組1~4周時,大鼠結(jié)腸組織中5-HT免疫陽性反應(yīng)的細胞數(shù)目明顯減少(**P<0.01,***P<0.001);C: 各組大鼠血清中5-HT濃度的變化;與ND組相比,D組3、4周時,血清中5-HT含量明顯降低(**P<0.01,***P<0.001);ND: 非糖尿病;D: 糖尿病

    2.2 糖尿病模型大鼠結(jié)腸組織內(nèi)TPH1的蛋白水平無變化

    Western印跡法結(jié)果顯示: 與非糖尿病組大鼠相比,糖尿病組4周時大鼠結(jié)腸黏膜組織中TPH1的表達水平?jīng)]有發(fā)生顯著的變化,見圖2。

    圖2 STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病模型大鼠結(jié)腸黏膜層 組織內(nèi)TPH1蛋白水平的變化Fig.2 The change in TPH1 protein level in mucosa of colon in STZ-induced type 1 diabetic rats D組與ND 4周組大鼠結(jié)腸黏膜層組織內(nèi)TPH1的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.6913);ND: 非糖尿病; D: 糖尿病

    2.3 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠血糖和體質(zhì)量的影響

    進一步觀察了外源性補充5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量和血糖的影響。結(jié)果顯示: 與非糖尿組大鼠相比,糖尿病對照組大鼠出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量下降(圖3B)和血糖升高(圖3C);外源性給予5-HT后,與糖尿病對照組相比,糖尿病5-HT處理組(D-5-HT)體質(zhì)量(圖3B)和血糖(圖3C)均沒有較大的變化。

    圖3 外源性5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量和血糖的影響Fig.3 The effects of exogenous 5-HT on body weight and blood glucose of diabetic ratsA: 給予動物外源性5-HT方案;B、C: 外源性5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量與血糖的影響[糖尿病對照動物體質(zhì)量下降和血糖升高(**P<0.01,***P<0.001);外源性給予5-HT對糖尿病大鼠體質(zhì)量下降沒有影響;外源性5-HT給藥后1周可輕微減輕了糖尿病大鼠血糖的升高,但是依然高于15mmol/L;給藥后2周5-HT對糖尿病大鼠血糖升高無影響];ND: 非糖尿病;D: 糖尿病

    2.4 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙的影響

    進一步觀察了外源性補充5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸功能的影響。結(jié)果如圖4所示: 與非糖尿病組大鼠相比,STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病組大鼠排出帶紅色染料糞便的時間明顯延長,即變化百分比增大[非糖尿病組為(100.0±36.9)%,糖尿病組為(354.4±58.7)%,P=0.032],說明1型糖尿病模型大鼠的結(jié)腸動力功能出現(xiàn)了一定的障礙;外源性給予5-HT能明顯縮短糖尿病大鼠結(jié)腸運輸時間,即變化百分比下降[糖尿病組為(354.4±58.7)%,糖尿病5-HT組為(101.4±34.9)%,P=0.050]。

    圖4 外源性給予5-HT對糖尿病大鼠結(jié)腸動力功能的影響Fig.4 The effect of exogenous 5-HT on the colonic motility of diabetic rats與ND組相比,##P<0.01;與DC組相比,**P<0.01;ND: 非糖尿病;DC: 糖尿病對照

    3 討 論

    糖尿病是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂。2013年流行病學(xué)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,世界范圍內(nèi)約有3.8億糖尿病患者,預(yù)計到2030年會達到6億[8]。糖尿病患者血糖的升高,往往累及多種器官并引起并發(fā)癥,其中,胃腸道并發(fā)癥最為常見[9],比如胃輕癱、便秘等,也有研究表明糖尿病患者結(jié)直腸癌患病風(fēng)險增高[10];這些均嚴(yán)重影響糖尿病患者的生活質(zhì)量,而臨床治療仍存在諸多限制。

    外周5-HT主要由腸嗜鉻細胞(enterochromaffin cell, EC)分泌,參與機體生理與病理狀態(tài)下的多種反應(yīng)。5-HT在糖尿病模型動物體內(nèi)的含量變化是研究者關(guān)注的熱點: 在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病大鼠中,十二指腸EC的數(shù)量與5-HT的含量均顯著增高[11];四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型成模6周后,從胃到結(jié)腸等不同部位5-HT含量急劇下降[5];在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠全血5-HT含量下降,而腸道5-HT含量明顯上升[12]。上述研究表明5-HT變化與模型建立方法、檢測時間結(jié)點和檢測部位有關(guān)。本研究通過對STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠進行結(jié)腸5-HT免疫陽性細胞的計數(shù)及心臟動脈血血清5-HT含量的連續(xù)監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)糖尿病模型建立后1周,結(jié)腸黏膜層中5-HT免疫陽性細胞數(shù)目即開始減少,且隨著糖尿病的進程呈進行性減少,具有時間依賴性;而且血清5-HT的含量也在模型建立后3周顯著降低,可見在STZ誘導(dǎo)1型糖尿病大鼠進程中,結(jié)腸和外周的5-HT水平總體處于一個缺乏的狀態(tài)。由于5-HT的合成是通過TPH1對色氨酸進行羥基化而引發(fā)的,而TPH1是5-HT合成的限速酶;因此,5-HT的產(chǎn)生受TPH1的活性和色氨酸的可用性調(diào)節(jié)[3]。所以本研究檢測了糖尿病進程中結(jié)腸5-HT合成的主要限速酶TPH1的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病動物結(jié)腸黏膜層組織中TPH1的表達沒有明顯變化,提示在糖尿病發(fā)展過程中,5-HT的合成速率沒有發(fā)生改變。近年來,腸道菌群紊亂與1型糖尿病之間的相關(guān)性受到學(xué)者關(guān)注[13-15],而腸道菌群影響5-HT的合成和分泌[16],今后會進一步研究腸道菌群紊亂與1型糖尿病與外周5-HT水平下降之間的關(guān)系。

    有研究提示5-HT參與糖代謝和胰島素分泌的調(diào)控: 在正常個體中,5-HT可以降低正常小鼠的血糖,改變其血清胰島素水平;但是在STZ誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠中,5-HT既不改變血糖水平,也不改變其血清內(nèi)胰島素的水平[17];然而,在2型糖尿病患者中,5-HT可刺激胰島素釋放[18]。本實驗證明了外源性給予糖尿病大鼠5-HT后,1型糖尿病大鼠的體質(zhì)量和血糖并沒有明顯的改變。這進一步說明,5-HT對1型糖尿病大、小鼠的血糖升高均沒有抑制作用。綜上,5-HT可能對糖尿病個體糖代謝及胰島素分泌的調(diào)控與糖尿病的類型有關(guān)。

    糖尿病腸道動力障礙的發(fā)生機制復(fù)雜多樣: 平滑肌細胞功能損傷[19]、Cajar間質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)和功能異常[20-21]、自主神經(jīng)病變[22-23]、胃腸神經(jīng)元病變[24-25]、胃腸激素分泌異常[26-27]、巨噬細胞極化狀態(tài)改變[28]等均可以引起糖尿病的胃腸動力障礙。5-HT以旁分泌的形式,參與調(diào)控胃腸蠕動和分泌,對胃腸動力具有促進作用,若EC細胞或5-HT信號通路發(fā)生異常,可能會導(dǎo)致胃腸動力出現(xiàn)相應(yīng)的異常變化。本實驗結(jié)果證明,糖尿病動物存在結(jié)腸動力障礙,而且結(jié)腸和外周血清中5-HT水平呈進行性下降,而外源性給予5-HT能改善糖尿病動物的結(jié)腸動力障礙,增加動物排出糞便的速度。這進一步說明,5-HT的減少,與糖尿病結(jié)腸動力障礙存在一定的相關(guān)性。外源性補充5-HT可能通過多方面的作用改善結(jié)腸動力障礙: (1) 5-HT可能通過5-HT4型受體直接作用于腸神經(jīng)系統(tǒng)感覺神經(jīng)元、中間神經(jīng)元和運動神經(jīng)元,引起乙酰膽堿、P物質(zhì)和CGRP協(xié)同釋放促進平滑肌收縮[29];(2) 5-HT可能通過5-HT4型受體減輕神經(jīng)損傷死亡[30-31]進而抑制糖尿病自主神經(jīng)和/或胃腸神經(jīng)病變改善動力障礙。這一推測尚需進一步驗證。

    綜上,外周5-HT水平隨1型糖尿病進程呈進行性減少,且結(jié)腸動力功能出現(xiàn)障礙,而補充外源性5-HT可以改善糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙,但不能抑制血糖升高。這些結(jié)果提示,1型糖尿病外周5-HT水平的下降可能與結(jié)腸動力障礙有關(guān),外源性5-HT改善腸道動力功能的作用機制有待探討。

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