高產(chǎn)吡嗪類物質(zhì)芽孢桿菌在高溫大曲中的應用研究

沈 毅，陳 波，張亞東，甘浪飛，謝 娟

（四川省古藺郎酒廠有限公司，四川古藺 646523）

眾所周知“曲乃酒之骨”“好曲出好酒”“曲定酒型”，高溫大曲是“醬酒”中醬香、曲香、焦香等典型香氣特征的重要來源之一。吡嗪類物質(zhì)是含有2個對稱氮原子的六元雜環(huán)化合物，具有蒸汽壓低、易揮發(fā)，且香勢強、香味閾值低的特點，它主要由還原糖和游離氨基酸經(jīng)細菌發(fā)酵和熱處理而產(chǎn)生，是高溫大曲中具有特殊香味的物質(zhì)。研究表明[1]，醬香型白酒中的含量較高的吡嗪類物質(zhì)主要集中于2-乙基-6-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪等，而2,3,5,6-四甲基吡嗪又是其中含量最高的。徐巖等[2]曾深入研究過白酒中四甲基吡嗪的來源及產(chǎn)生機制，并首次提出白酒中四甲基吡嗪的產(chǎn)生主要來源于微生物代謝反應。

微生物種類與數(shù)量直接影響高溫大曲的風味物質(zhì)組成，決定著醬香型白酒的品質(zhì)。由于生料制曲過程的開放性、多酶多菌固態(tài)混合發(fā)酵體系的復雜多樣性以及固態(tài)發(fā)酵難以監(jiān)測調(diào)控等眾多因素，常常影響醬香型高溫大曲質(zhì)量的穩(wěn)定性。為改善和提高高溫大曲品質(zhì)，在發(fā)酵過程中添加純種外源微生物已經(jīng)成為一種廣泛采用的手段，可以豐富大曲中微生物群系和維持特定微生物細胞濃度。本研究采用分離純化、發(fā)酵篩選、形態(tài)結(jié)構鑒定等方法，從郎酒糖化堆糟醅中篩選出兩株高產(chǎn)吡嗪類的地衣芽孢桿菌L8和枯草芽孢桿菌L17，將兩菌株混合添加于麥料或稻草中，模擬高溫大曲生產(chǎn)應用，以期提升高溫大曲質(zhì)量，為生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)醬香型高溫大曲奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌種：本研究所用菌株是從郎酒糖化堆中篩選出來的地衣芽孢桿菌L8、L17，按1∶1比例制成菌液待用。

原輔料：所用高溫大曲、稻草等原輔料均來源于四川省古藺郎酒廠有限公司。

試劑：所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器設備：Stable Flex 纖維頭（50/30 μ m DVB/Carboxen/PDMS）、57550-U 手動萃取手柄，美國Supelco 公司；7890A-5975C 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司；高精度電子分析天平，上海精科儀器有限公司；SCQ-2201系列超聲波清洗機，上海聲彥超聲波儀器有限公司；TDL-50 臺式低速離心機，常州梅香儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高溫大曲生產(chǎn)操作

小麥經(jīng)過浸潤，粉碎，再添加母曲5%，添加母曲后，將備好的混合菌液分別按0.1 ‰、0.5 ‰、1 ‰、2 ‰、5 ‰的比例添加至粉碎的麥料（50 kg/份）中（此為將菌液添加至粉碎的麥料組，簡稱“麥料組”），以未添加功能菌液的麥料3 份作為空白對照（簡稱“空白組”）。再模擬高溫大曲工藝進行拌和水分，踩曲、安曲、翻曲、拆曲出倉等一系列操作。另選麥料中沒有添加菌液的麥料3 份，將菌液添加至安曲過程使用的稻草中，按1‰接種比例添加至稻草中（此為將菌液添加至稻草中，簡稱“稻草組”）。其中混合菌液采用一種地衣芽孢桿菌和一種枯草芽孢桿菌按1∶1 比例混合而成，3 組操作同時進行，各組曲坯做好標記，具體要求如下：

將粉碎后的麥料攪拌均勻，再分成若干小堆，每堆準確稱量至50 kg，根據(jù)要求分成“麥料組”“空白組”“稻草組”，同時拌和操作，“麥料組”添加不同比例菌液和適量水，“空白組”與“稻草組”只添加適量水，控制麥料拌和水分為39%，經(jīng)過曲模制成大小相同的曲塊，保證曲坯長、寬、高、曲包幅度一致，晾曲15 min，便統(tǒng)一進行安曲操作。其中“稻草組”在安曲時采用添加過1 ‰菌液的稻草，“空白組”“麥料組”的稻草需要添加同樣數(shù)量的水。安曲時，在稻草使用數(shù)量，稻草厚度和使用方式相同的前提下，保證“麥料組”“空白組”“稻草組”在曲堆同一層，采用編織布隔離區(qū)分，并做好標記，培菌發(fā)酵40 d左右，前28 d每天對各組進行溫度測量。

分別于第一次翻曲時、第二次翻曲時、出倉時立即取樣，并測定各組曲坯的水分、酸度、糖化力、蛋白質(zhì)、三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量。對第一次翻曲、第二次翻曲和出倉時各組曲坯進行頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction）結(jié)合GC-MS分析，同時對各組曲塊進行感官鑒定。

1.2.2 曲坯中香味物質(zhì)測定[3-5]

本研究香味物質(zhì)主要以特征香味物質(zhì)三甲基吡嗪、四甲基吡嗪為參考目標，采用頂空固相微萃取(HS-SPME)技術結(jié)合GC-MS分析曲坯中揮發(fā)性成分及吡嗪類物質(zhì)的含量。

樣品處理：取曲坯15 g，研磨充分后加入30 mL蒸餾水浸泡10 min，然后攪拌加超聲波處理30 min，離心取上清液5 mL 于15 mL 萃取瓶中，加入2 g NaCl(酒樣稀釋10 倍，則直接取5 mL 于15 mL 萃取瓶中，不加NaCl)。插入裝有2 cm-50/30μ m DVB/Carboxen/PDMS StableFlex 纖維頭的手動進樣器，在60 ℃左右頂空萃取45 min 取出，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中，熱解析4 min進樣。采用全掃描模式對曲坯中揮發(fā)性成分進行檢測。

氣相色譜條件：色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，柱溫35 ℃(保持5 min)，以4 ℃/min升溫至135 ℃，再以8 ℃/min升溫至180 ℃保持5 min，運行時間43 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦(He，99.999%)；柱前壓7.62 psi，載氣流速0.8 mL/min；分流進樣，分流比為20∶1；溶劑延遲時間2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)，離子源溫度230 ℃，接口溫度250 ℃。

定性定量方法：采用選擇離子掃描模式對三甲基吡嗪、四甲基吡嗪的4 個特征離子進行掃描。根據(jù)峰面積與含量成正比的關系，用GC-MS 聯(lián)用儀計算其峰面積對應的響應值，根據(jù)已建立的四甲基吡嗪響應值-濃度標準曲線，得到曲坯中三甲基吡嗪、四甲基吡嗪含量。

1.2.3 曲坯糖化力、蛋白質(zhì)、水分、酸度含量的測定

糖化力測定參照白酒生產(chǎn)技術全書中的糖化酶活力測定[6]；蛋白質(zhì)測定參照國標GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法測定[7]；水分測定參照國標GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的方法測定[8]；酸度測定參照國標GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》中方法測定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加方式對曲坯理化指標的影響

該實驗分別對1‰菌液添加量的“麥料組”“空白組”“稻草組”在第一次翻曲、第二次翻曲及出倉時曲坯的理化指標（糖化力、蛋白質(zhì)含量、水分、酸度、三甲基吡嗪含量、四甲基吡嗪含量）進行了測定，不同添加方式的理化指標見表1。

表1 不同菌液添加方式的理化指標

由表1 可知，其中“麥料組”“空白組”“稻草組”曲坯的同一階段的水分與酸度相差不大?！胞溋辖M”曲坯在30 ℃下第一次翻曲、第二次翻曲、出倉后糖化力分別為19 mg/g·h、50 mg/g·h、95 mg/g·h，對比“空白組”和“稻草組”，發(fā)現(xiàn)糖化力為出倉＞第二翻曲＞第一次翻曲。同等添加量下，同階段發(fā)酵后曲坯的蛋白質(zhì)消耗量、三甲基吡嗪與四甲基吡嗪生成量為“麥料組”＞“稻草組”＞“空白組”?！胞溋辖M”曲坯中四甲基吡嗪含量為6.86 μ g/g，而“空白組”只有1.78 μ g/g，“稻草組”只有2.68 μ g/g。在高溫大曲生產(chǎn)中，添加功能性微生物芽孢桿菌混合液，其特征香味物質(zhì)的提升強度跟其添加的方法有著密不可分的聯(lián)系，添加菌液在麥料中一是會很大程度地改變原有菌落結(jié)構狀態(tài)，二是使曲坯在制作、晾曲、安曲堆積過程中功能性微生物大量繁殖和代謝，為生成大量香味及其前體物質(zhì)提供可能。

圖1 發(fā)酵倉內(nèi)各組曲坯的溫度變化圖

從圖1 可以看出，在發(fā)酵倉內(nèi)前8 d，“麥料組”升溫幅度較“空白組”“稻草組”大，升溫速率快，挺溫60 ℃以上時間長。第一次翻曲后，發(fā)酵9～12 d時，“麥料組”升溫快，溫度較另兩組高。而制曲溫度影響微生物種群、數(shù)量、生化反應、生物酶活力等，從而影響曲藥發(fā)酵及風味物質(zhì)的生成。高溫使各種耐高溫酶活力提高或正常發(fā)揮，大量提高生化反應速率；高溫使美拉德、焦糖化等褐變反應正常進行；高溫利于香味物質(zhì)及其前體形成，如四甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2-甲基吡嗪、3-羥基-2-丁酮（乙偶姻）、2，5-二甲基吡嗪、吡啶、糠醛等。

2.2 菌液添加量對曲坯理化指標的影響

該試驗對“麥料組”使用不同比例（0.1 ‰、0.5‰、1‰、2‰、5‰）添加菌液，對曲坯在第一次翻曲、第二次翻曲及出倉時曲坯的理化指標（糖化力、蛋白質(zhì)含量、水分、酸度、三甲基吡嗪含量、四甲基吡嗪含量）進行了測定，相關結(jié)果如圖2。

圖2 菌液添加量對“麥料組”曲坯中糖化力的影響

從圖2 可以看出，在相同菌液添加量下，“麥料組”曲坯的糖化力為出倉＞第二次翻曲＞第一次翻曲。隨著添加量的增加曲坯的糖化力逐漸增大，隨著菌液量的增多，對曲坯自身微生物之間相互作用增強，微生物多樣性高，提升了產(chǎn)糖化酶微生物種類，從而曲坯糖化能力增強。

圖3 菌液添加量對“麥料組”曲坯中水分含量的影響

從圖3 可以看出，在相同菌液添加量下，第一次翻曲、第二次翻曲至出倉時“麥料組”曲坯水分逐漸降低。曲坯正常發(fā)酵，微生物生長繁殖產(chǎn)能產(chǎn)熱，將水分逐漸揮發(fā)與吸收，直到微生物活動減弱。而不同菌液添加量對“麥料組”曲坯中水分含量影響較小，水分含量很大程度與發(fā)酵倉溫度、空氣流動速率與曲坯間氧氣含量等有直接關系。

圖4 菌液添加量對“麥料組”曲坯中酸度的影響

從圖4 可以看出，在相同菌液添加量下，各階段“麥料組”曲坯酸度大小為第一次翻曲＞第二次翻曲＞出倉。隨著菌液添加量的增加，當添加量為1 ‰時，曲坯酸度較高，一定的酸度利于小麥原料物質(zhì)成分的分解，同時為合成酯類、吡嗪等香味物質(zhì)提供物質(zhì)基礎與保障。但實際生產(chǎn)中對酸度也有控制，并非越高越好。酸度過高會不利于褐變反應的進行。適當?shù)乃岫扔欣趨捬酢⒓嫘詤捬蹙纳L繁殖和酶作用的發(fā)揮（淀粉酶、蛋白酶的pH 值為5±0.5），而從醬香型高溫大曲分離得到大多芽孢桿菌均為兼性厭氧菌，如地衣芽孢桿菌、多粘芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌等。因而控制發(fā)酵過程中曲坯在適宜的酸度范圍顯得尤為重要。

圖5 菌液添加量對“麥料組”曲坯中蛋白質(zhì)含量的影響

由圖5 可知，“麥料組”發(fā)酵后半成品曲（出倉曲）中殘留蛋白質(zhì)含量隨接種菌液的數(shù)量增加而總體呈下降趨勢。在同樣的菌液添加量時，出倉曲殘留蛋白含量低于第一次翻曲和第二次翻曲。蛋白質(zhì)減少可能與加入的芽孢桿菌液自身生長消耗及代謝利用部分蛋白質(zhì)將其轉(zhuǎn)化成氨基酸、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪等物質(zhì)有關。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌產(chǎn)生的中性蛋白酶與其他微生物產(chǎn)生的蛋白酶協(xié)同作用，能降解復雜蛋白質(zhì)，對提升高溫大曲的品質(zhì)有積極作用。

圖6 菌液添加量對“麥料組”曲坯中三甲基吡嗪含量的影響

由圖6、圖7 可知，第一次翻曲和第二次翻曲的曲坯中三甲基吡嗪和四甲基吡嗪含量都較低。從圖7 可以看出，“麥料組”出倉后最低四甲基吡嗪含量為3.45 μ g/g，當添加量達到1 ‰時，其四甲基吡嗪含量達到最高值為6.86 μ g/g，是空白組1.78 μ g/g的3.85 倍。其次為5 ‰添加量的“麥料組”的四甲基吡嗪含量為6.37 μ g/g。而三甲基吡嗪含量變化規(guī)律同四甲基吡嗪相似，因而選擇1‰添加量便可有效提升曲坯中吡嗪類香味物質(zhì)含量。

圖7 菌液添加量對“麥料組”曲坯中四甲基吡嗪含量的影響

2.3 接入功能菌后曲坯感官分析

各組出倉曲坯分別送于專業(yè)的曲藥鑒定師進行暗評，評價方法參照《郎酒醬香型高溫大曲半成品曲驗收標準》，各組曲坯鑒評結(jié)果詳見表2。

由表2 可以看出，“麥料組”的半成品曲坯的色澤和外觀、香味、斷面均優(yōu)于“稻草組”“空白組”的曲坯。高溫優(yōu)質(zhì)大曲一般為黃褐色，曲塊干，表皮薄，有醬香曲香味，豉香濃郁，無異味，而“麥料組”曲坯便是如此。

表2 各組的半成品曲坯感官鑒定表

3 結(jié)論

本研究從糟醅中分離得到的芽孢桿菌，按比例混合制成菌液，模擬醬香型高溫大曲生產(chǎn)工藝進行應用實驗。結(jié)果表明，不同菌液添加量對曲坯發(fā)酵存在影響，發(fā)現(xiàn)“麥料組”菌液添加量為1‰時最佳，所得半成品曲坯中吡嗪類物質(zhì)含量較高，是“空白組”的3.85 倍；菌液添加方式上，在麥料中直接添加所制的曲坯的特征香味物質(zhì)含量、曲坯感官質(zhì)量均優(yōu)于稻草中添加。