不同釀造條件對黃酒中精氨酸代謝的影響研究

楊曉婷，陸筑鳳，趙可及，李娟娟，李加友

（嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbomate，EC）是釀造酒中可能會出現(xiàn)的一種2A 級致癌物，酒中氨基甲酸乙酯的形成受不同原料和釀造工藝的影響。黃酒中含有豐富的精氨酸，精氨酸可降解產(chǎn)生尿素、瓜氨酸或氨甲酰磷酸，而這些物質(zhì)都能與乙醇作用形成氨基甲酸乙酯[1]。因此，控制黃酒中精氨酸的代謝有利于降低成品酒中氨基甲酸乙酯的含量。

酒中精氨酸的代謝絕大部分源于酵母降解精氨酸的尿素循環(huán)途徑（urea cycle pathway）和乳酸菌的精氨酸脫亞胺途徑（arginine deiminase pathway，簡稱ADI 途徑）。發(fā)酵起始階段酵母快速利用精氨酸產(chǎn)生尿素，酵母細(xì)胞會將過高濃度的尿素排出胞外[2]。采用基因敲除方法構(gòu)建精氨酸酶基因缺失的清酒酵母，該酵母釀造清酒過程中未發(fā)現(xiàn)尿素的累積現(xiàn)象[3]。將脲基酰胺酶基因DUR1,2 克隆到TPI 強(qiáng)啟動子和終止子之間的位點，再通過同源重組方式將受強(qiáng)啟動子調(diào)控的目的基因整合到黃酒酵母的基因組中，獲得低產(chǎn)尿素的黃酒酵母85#DUR1,2，其產(chǎn)尿素量比出發(fā)菌株降低了69.9%[4]。利用改造過的不同菌株生產(chǎn)黃酒，EC 含量降低正比于尿素的下降量[5]。通過在黃酒發(fā)酵過程中添加低濃度抑制劑L-鳥氨酸鹽酸鹽，有利于瓜氨酸積累，從而激發(fā)OTC 酶表達(dá)，酶解瓜氨酸速度加快直接導(dǎo)致EC 生成量降低[6]。在黃酒釀造后期添加硫酸銨作為補(bǔ)充氮源，能在一定水平上降低氨基甲酸乙酯的濃度[7]。從濃香型白酒酒醅中分離到具有高精氨酸利用能力和高瓜氨酸積累特性的乳酸菌類菌株，通過基因型和表現(xiàn)型驗證以及模擬窖內(nèi)發(fā)酵均證實它們可以促進(jìn)瓜氨酸積累[8]。

在不影響產(chǎn)品品質(zhì)的前提下，本文擬利用工藝控制方法限制發(fā)酵過程中精氨酸的代謝，從而減少尿素、瓜氨酸等氨基甲酸乙酯前體物的形成。

1 材料與方法

1.1 材料

原輔料：糯米，市售；紅曲米，古田縣帝源紅曲廠；麥曲，江蘇微康生物科技有限公司；酒曲和黃酒酵母，安琪酵母股份有限公司；乳酸菌粉，北京川秀國際貿(mào)易有限公司。

耗材及試劑：精氨酸、2,4-二硝基氟苯（DNFB）、D5-氨基甲酸乙酯均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、乙醚均為色譜純；硼酸、碳酸氫鈉、無水乙酸鈉、正己烷均為分析純。堿性硅藻土固相萃取柱，填料4000 mg，柱容量12 mL。

1.2 主要儀器和設(shè)備

戴安U3000 高效液相色譜儀（美國戴安公司），氣相色譜-質(zhì)譜儀（美國熱電公司）。

1.3 黃酒的釀造

500 g糯米浸泡48 h，蒸飯前瀝干，上汽蒸25 min。用攤飯法冷卻米飯溫度至28 ℃時，將其加入發(fā)酵缸中，然后加入25 g 麥曲、5 g 黃酒酵母（加入前按照使用說明進(jìn)行活化）、1000 mL 溫開水（溫度40 ℃），攪拌均勻，使得發(fā)酵劑均勻分布。將發(fā)酵缸置于25 ℃培養(yǎng)箱，5 d 后將培養(yǎng)溫度調(diào)整為18 ℃，并用檸檬酸調(diào)節(jié)體系的pH值為3.5。發(fā)酵過程中每隔14 d 定期取樣檢測醪液中的精氨酸含量；并且檢測了第56 天醪液中的EC 含量。實驗中，只將上述操作中需要考察的參數(shù)按照方案進(jìn)行調(diào)整，而其他參數(shù)保持不變。以上工藝均按照無菌操作要求，嚴(yán)格控制環(huán)境中雜菌進(jìn)入發(fā)酵體系。

1.4 精氨酸含量的測定

準(zhǔn)確移取0.5 mL 酒樣、0.5 mol/L NaHCO3溶液0.5 mL 和25 mL/L DNFB 衍生化試劑0.2 mL 置于10 mL試管中，混合后置于60 ℃水浴中避光恒溫加熱60 min，避光冷卻至室溫后用pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液定量至5 mL，靜置15 min，過0.22 μm 膜后可進(jìn)樣分析。

采用戴安U-3000高效液相色譜儀，其中色譜柱為Acclaim120，C18，5 μm Analytical（4.6×250 mm），紫外檢測波長360 nm，進(jìn)樣量為20μL，柱溫30 ℃，流動相B 為超純水，流動相C 為乙腈溶液，流動相D為乙酸鈉，流速0.8 mL/min，時間26 min。梯度洗脫程序見表1。

表1 高效液相色譜的洗脫條件

1.5 氨基甲酸乙酯含量的測定

取2 g經(jīng)5 min超聲脫氣后的黃酒，加入100μL的2.00μg/mL D5-氨基甲酸乙酯使用液，加入0.3 g氯化鈉，超聲溶解，混勻后，在真空條件下加入堿性硅藻土固相萃取柱，靜置10 min。先用10 mL 正己烷淋洗，再用10 mL 的5 %乙酸乙酯-乙醚溶液以1 mL/min 的流速進(jìn)行洗脫，用裝有2 g 無水硫酸鈉的玻璃漏斗對洗脫液進(jìn)行脫水，室溫下氮吹至0.5 mL，用甲醇定容至1.00 mL 制成定液。氣相色譜-質(zhì)譜儀分析參考條件見表2。

表2 氣相色譜-質(zhì)譜儀分析參考條件

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對黃酒中精氨酸含量的影響（表3）

表3 乳酸菌含量對黃酒中精氨酸代謝的影響

傳統(tǒng)黃酒釀造屬于開放式操作，環(huán)境微生物種類和數(shù)量是影響產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素[9-10]，其中來源于環(huán)境中的乳酸菌是影響黃酒釀造的重要微生物之一。乳酸菌可以通過ADI 代謝途徑分解精氨酸產(chǎn)生瓜氨酸和氨甲酰磷酸，這兩種代謝產(chǎn)物均為形成EC 的前體物質(zhì)。通過比較發(fā)酵體系中乳酸菌的不同含量對醪液中精氨酸含量的過程變化和產(chǎn)品中EC 含量的影響，考察黃酒釀造過程中乳酸菌對精氨酸代謝和EC 形成的作用。結(jié)果表明，乳酸菌含量越高，醪液中檢測到的精氨酸濃度就越低，產(chǎn)品中EC 含量越高。未添加乳酸菌處理的精氨酸含量為33.87 mg/L，添加0.1 g 乳酸菌的醪液中精氨酸含量僅為10.43 mg/L，下降了69%；而氨基甲酸乙酯的含量卻從0.226 mg/L 上升到0.264 mg/L，增加了17 %。在黃酒釀造中，乳酸菌有明顯的精氨酸代謝能力，隨著乳酸菌含量的增加，精氨酸代謝速度變快，精氨酸的轉(zhuǎn)化率也更高，產(chǎn)生了更多的氨基甲酸乙酯前體物質(zhì)，因此形成了更多的氨基甲酸乙酯。

2.2 酵母菌對黃酒中精氨酸代謝的影響（表4）

酵母菌中的精氨酸水解酶可以將精氨酸轉(zhuǎn)化為尿素，也是形成EC 的重要前體物質(zhì)。選取3 種不同酵母菌，分別為黃酒專用安琪釀酒高活性干酵母（簡稱黃酒酵母）、釀酒酵母ZJXU、釀酒酵母ZJXU1508，比較不同酵母菌對精氨酸代謝的影響。結(jié)果表明，3 種酵母中以黃酒酵母的精氨酸代謝能力最強(qiáng)，醪液中的氨基甲酸乙酯含量也較另外兩個菌株的處理更高。釀酒酵母ZJXU 是我們篩選所得，釀酒酵母ZJXU1805 是在釀酒酵母ZJXU的基礎(chǔ)上經(jīng)過進(jìn)一步選育出來的生產(chǎn)菌株，醪液中的精氨酸含量較出發(fā)菌株增加31 %，氨基甲酸乙酯含量下降15%，釀酒酵母ZJXU1805 能明顯降低氨基甲酸乙酯的形成。方逸群等[11]曾對釀酒酵母進(jìn)行過選育，也獲得了低產(chǎn)氨基甲酸乙酯工程菌株，菌株選育是控制產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯含量的一種有效手段。

表4 酵母對黃酒中精氨酸代謝的影響

2.3 紅曲米對黃酒中精氨酸代謝的影響（表5）

表5 紅曲米對黃酒中精氨酸代謝的影響

在浙江、福建等地釀造黃酒時有添加紅曲的習(xí)慣，一方面紅曲米可以改善酒液的顏色，另一方面，紅曲也可以產(chǎn)生酒精，是一種釀酒微生物[12]。在黃酒釀造過程中添加部分紅曲，比較醪液中精氨酸的代謝情況，發(fā)現(xiàn)精氨酸的含量隨著紅曲米添加量的增大而顯著增加；28 d以后，添加了紅曲米的醪液中精氨酸含量有所下降。隨著紅曲米用量的增加，氨基甲酸乙酯含量也顯著增加，紅曲米用量為2.00 g時，醪液中的精氨酸含量最高，達(dá)到57.11 mg/L，較不添加紅曲米的對照組提高了86 %，醪液中的氨基甲酸乙酯也增加了61%。紅曲米中的紅曲菌能產(chǎn)生精氨酸，并分泌到醪液中，而精氨酸的進(jìn)一步水解產(chǎn)生了氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)[13]，促進(jìn)了氨基甲酸乙酯的形成。

2.4 醪液pH值對黃酒中精氨酸代謝的影響（表6）

表6 醪液pH值對黃酒中精氨酸代謝的影響

傳統(tǒng)黃酒釀造過程采用開放式操作，環(huán)境微生物進(jìn)入醪液后會改變產(chǎn)品品質(zhì)，通常會添加酸漿水[14]降低醪液pH 值達(dá)到控制雜菌生長的效果，因此有“三漿四水”的工藝。但是，黃酒釀造中發(fā)揮作用的微生物種類較多，不同pH 值條件下微生物的代謝不同，也會對酒的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[15]。根據(jù)傳統(tǒng)黃酒釀造中醪液pH 值，比較不同pH 值對黃酒釀造中微生物代謝精氨酸的影響。結(jié)果表明（表6），不同處理中精氨酸含量隨著釀造時間延長而有所上升，特別是在相對較高pH 值時，精氨酸含量會成倍增加，28 d 時檢測到pH4.5 的醪液中精氨酸含量是pH2.5 時的醪液的4.9 倍；但是從28 d 開始精氨酸含量保持相對穩(wěn)定，沒有明顯變化。而pH4.5時的醪液中氨基甲酸乙酯含量卻僅為pH2.5 的醪液的74%。當(dāng)醪液的pH 值相對較低時，體系中精氨酸的含量較少，隨著醪液pH 值的上升，精氨酸含量呈上升趨勢，而氨基甲酸乙酯的含量呈下降趨勢。可能是在較低pH 值時促進(jìn)了精氨酸的分解，因此醪液中檢測到的精氨酸含量較低，而氨基甲酸乙酯的含量卻明顯增加。

3 結(jié)論

通過對乳酸菌、醪液pH 值、酵母菌和紅曲菌的單因素比較，初步確定了以上4 個因素對黃酒中精氨酸形成和水解的影響，并建立起與氨基甲酸乙酯形成的相關(guān)性。乳酸菌具有較強(qiáng)的精氨酸代謝能力，有明顯促進(jìn)氨基甲酸乙酯形成的作用；而醪液pH 值越低，檢測到的精氨酸濃度越低，低pH 值環(huán)境可以誘導(dǎo)乳酸菌代謝精氨酸脫亞胺，產(chǎn)生氨來提高環(huán)境的pH 值以更有利于菌的生長[12]，而代謝產(chǎn)生的瓜氨酸和氨甲酰磷酸都是形成氨基甲酸乙酯的前體物質(zhì)，因此低pH 值醪液中的氨基甲酸乙酯含量顯著升高。酵母菌對氨基甲酸乙酯的形成有明顯的影響，不同菌株的精氨酸水解能力不同，產(chǎn)生尿素的量也就不一樣，利用低水解酶活性的酵母釀酒，有利于控制產(chǎn)品中氨基甲酸乙酯的形成。紅曲霉可以產(chǎn)生精氨酸，也可以水解精氨酸，因此添加紅曲的黃酒中氨基甲酸乙酯含量明顯高于不添加紅曲的。

因此，使用特定的釀酒酵母，并在釀造過程中控制環(huán)境中乳酸菌進(jìn)入醪液中，保持合適的pH 值等都是控制氨基甲酸乙酯形成的有效措施，結(jié)合產(chǎn)品現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的調(diào)整，可以有效降低黃酒中氨基甲酸乙酯的含量。