朱櫻花組培快繁技術(shù)研究

謝云巧，寧玲，李小紅，陳華飛，廖良宇，趙掛東

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院，云南普洱 665000）

朱櫻花（Calliandra haematocephalaHassk.）又名美蕊花、紅合歡、紅絨球，豆科含羞草亞科朱櫻花屬植物，具有固氮能力、耐貧瘠、耐干旱、管理要求低、生長速度快，是綠化造林、改善土壤、改善生態(tài)環(huán)境的重要樹種；朱櫻花的葉含有大量蛋白質(zhì)，可作飼料；是紫膠蟲的寄主樹[1]；是一種可食用花卉，樹皮中含單寧，能促進(jìn)消化道蠕動(dòng)，改善便秘和食欲不振；具有很好的抗氧化性和抗炎作用[2]。朱櫻花的繁殖方法主要是種子繁殖和扦插繁殖。種子繁殖歷時(shí)長、處理過程繁瑣；常規(guī)扦插繁殖的插條生根困難、生根率低[3]。該試驗(yàn)在有關(guān)合歡[4～10]、相思[11～14]等木本植物快繁技術(shù)的基礎(chǔ)上，研究朱櫻花組織培養(yǎng)。目前已有研究采用的外植體均來源于成年外植體進(jìn)行組培，尚未見到有關(guān)采用朱花櫻種子自然萌發(fā)的幼苗的莖段作為外植體進(jìn)行組培的報(bào)道。朱櫻花所采用的外植體易發(fā)生褐變，為防止褐變，筆者以自然條件下種子播種生長的籽苗莖段、幼苗莖段和嫩葉，成年植株莖段和嫩葉作外植體。應(yīng)用朱櫻花組培快繁技術(shù)有效的克服傳統(tǒng)育苗缺陷，實(shí)現(xiàn)朱櫻花的工廠化育苗、大力推廣朱櫻花種植。

1 材料與方法

1.1 外植體的選取部位

該試驗(yàn)外植體分別來自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院內(nèi)3年生的朱櫻花成株以及2019年3月播種的朱櫻花幼苗。采集朱櫻花幼嫩的帶3～5個(gè)芽的莖尖、葉片、當(dāng)年春播有2～3片真葉的幼苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料的預(yù)處理

將處理好的外殖體分別用自來水沖洗2次后用低濃度洗衣粉水洗1次，自來水沖洗3次；在超凈工作臺(tái)上用 75%酒精消毒 10s，0.1%升汞消毒 5～10min后用無菌水沖洗3次。將外植體分割成0.5cm長的帶芽莖段和幼嫩的莖段后接種。以多年生嫩莖為外植體用 0.1%升汞分別消毒 8min、6min、5min，培養(yǎng)5d后進(jìn)行褐化率、污染率對(duì)比。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

愈傷組織誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)、分別采用設(shè)置10個(gè)處理、5個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)的方法。即設(shè)置10種不同的培養(yǎng)基配方，每個(gè)配方接種8瓶，每瓶接種外植體3個(gè)。該試驗(yàn)培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織、叢生芽誘導(dǎo)采用MS培養(yǎng)基，誘導(dǎo)生根采用1/2MS培養(yǎng)基。蔗糖濃度30g/L，瓊脂濃度6g/L。

1.2.3 培養(yǎng)條件

置于溫度（25±2)℃、光照強(qiáng)度1000～3000Lx、光照10h/d條件下培養(yǎng)。初代培養(yǎng)進(jìn)行4d的暗培養(yǎng)后再進(jìn)行光照培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 褐化率、污染率的對(duì)比試驗(yàn)

由于朱櫻花所采用的外植體易發(fā)生褐變，為防止褐變，筆者以自然條件下種子播種生長的籽苗莖段、多年生幼苗莖段和嫩葉作為外植體。采用75%酒精消毒10s和1%升汞不同的消毒時(shí)間來控制褐化率和污染率。表1說明，成年植株以帶芽莖尖為外植體用75%酒精消毒10s+1%升汞消毒6min褐化率、污染率明顯減少，而籽苗表現(xiàn)良好。在75%酒精消毒10s+1%升汞消毒8min、6min褐化率、污染率均為0%。

表1 1%升汞不同消毒時(shí)間對(duì)褐化污染的影響Tab.1 Effects of mercuric chloride different sterilizing time on the browning rate and pollution rate

2.2 愈傷組織誘導(dǎo)

2.2.1 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)

多年生嫩莖接種30d后，進(jìn)行愈傷組織統(tǒng)計(jì)。多年生嫩莖培養(yǎng)30d最佳的愈傷組織配方為BA1.5mg/L+NAA1.0mg/L，誘導(dǎo)率為87.5%。結(jié)果分析如表 2所示：

表2 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)Tab.2 Callus induction of perennial young stem

圖1 多年生嫩莖培養(yǎng)30d后產(chǎn)生的愈傷組織，愈傷組織顏色偏黃，小而緊實(shí)Fig.1 Callus produced by young perennial stems after 30 days of culture was yellowish，small and compact

圖2 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)Fig.2 Callus induction of perennial young stem

2.2.2 籽苗莖段、幼苗莖段和嫩葉愈傷組織誘導(dǎo)

籽苗莖段接種15d后，進(jìn)行愈傷組織統(tǒng)計(jì)。愈傷組織最佳培養(yǎng)基配方為 BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L，誘導(dǎo)率為100%。結(jié)果分析如表 3所示：

表3 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)Tab.3 Callus induction of new seedlings

圖3 籽苗培養(yǎng)15d產(chǎn)生的愈傷組織，顏色晶瑩偏綠，大而疏松Fig.3 Callus produced after 15 days of seedling culture showed a greenish,large and loose color

圖4 新生幼苗愈傷組合誘導(dǎo)Fig.4 Callus induction of new seedlings

2.3 叢生芽誘導(dǎo)

2.3.1 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)芽分化

多年生嫩莖產(chǎn)生的愈傷組織培養(yǎng)30d后沒有芽的分化，叢生芽誘導(dǎo)率為0%。結(jié)果分析如表 4所示：

表4 多年生嫩莖愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Tab.4 Callus induced bud differentiation in young perennial stems

2.3.2 幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化

在籽苗產(chǎn)生的愈傷組織的基礎(chǔ)上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)30d進(jìn)行發(fā)芽數(shù)統(tǒng)計(jì)，最佳培養(yǎng)基配方為BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L，誘導(dǎo)率為100%。結(jié)果分析如表5所示：

表5 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Tab.5 Callus induced bud differentiation in new seedlings

圖5 新生幼苗產(chǎn)生培養(yǎng)誘導(dǎo)的不定芽，分芽點(diǎn)多，小芽多Fig.5 New seedlings produced cultured adventitious buds,with more bud points and more small buds

圖6 新生幼苗愈傷組織誘導(dǎo)芽分化Fig.6 Callus induced differentiation in new seedlings

2.4 不定根誘導(dǎo)

將新生幼苗產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，在NAA0.5mg/L中進(jìn)行生根。

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用朱櫻花營養(yǎng)體器官即籽苗莖段，幼苗莖段和多年生春梢莖段作為研究的外植體。用籽苗和幼苗作為外植體不僅可以減少從朱櫻花未成熟種子、成熟種子中剝離幼胚進(jìn)行種子繁殖這一耗費(fèi)勞力的過程，而且通過朱櫻花快繁技術(shù)可以不受種子成熟程度、環(huán)境變化、天氣等自然因素的影響[15]，常年提供組培苗。就外植體的選擇，愈傷組織和叢生苗的誘導(dǎo)、以及在組培過程中褐變的處理等進(jìn)行了初步的研究，結(jié)果表明：消毒方法以多年生嫩莖為外植體用75%酒精消毒10s和1%升汞消毒6min，褐化率、污染率明顯減少。篩選合適的基因型和外植體，從源頭降低酚類物質(zhì)的含量是組培褐變防治的重要手段[16～18]。朱櫻花組織培養(yǎng)以籽苗作為外植體最好，愈傷組織誘導(dǎo)率高且不會(huì)褐化。愈傷組織最佳培養(yǎng)基配方為BA1.0mg/L+NAA2.0mg/L，在籽苗產(chǎn)生的愈傷組織的基礎(chǔ)上進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，最佳培養(yǎng)基配方為BA2.0mg/L+NAA1.5mg/L。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)籽苗除根以外都可產(chǎn)生愈傷組織；多年生春梢莖段產(chǎn)生愈傷組織后不會(huì)再分化但愈傷組織會(huì)變得松軟、易脫落直至死亡；多年生春梢莖段褐化現(xiàn)象只存在于第一次接種，轉(zhuǎn)接后不會(huì)發(fā)生。本研究為朱櫻花后續(xù)的進(jìn)一步研究提供了一定參考。