血管緊張素-(1-7)通過調(diào)控ClC-3氯離子通道及Nec對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷

程飛，李詩成，陳景福，李忠榮，賴國華，涂昌，蘭軍

(東莞市第三人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，東莞市心血管病研究所，廣東 東莞 523326)

血管緊張素-(1-7)[Ang-(1-7)]由血管緊張素轉(zhuǎn)換酶 2(ACE2)降解 Ang-Ⅱ而生成，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的一個(gè)重要成員，具有對(duì)抗 Ang-Ⅱ的作用。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-antiotensin system,RAS)在心血管疾病及代謝性疾病的發(fā)生中起重要的作用。最近有報(bào)道指出，糖尿病患者血漿Ang-(1-7)水平降低[1]，ACE2表達(dá)減少；ACE2過表達(dá)的糖尿病小鼠可改善血糖調(diào)控[2]；Ang-(1-7)的非肽類似物AVE-099可減輕糖尿病引起的心血管損害[3]。在敲除Mas受體基因的小鼠，對(duì)胰島素的敏感性和葡萄糖耐受性降低。而且，在轉(zhuǎn)基因的大鼠，通過過表達(dá)Ang-(1-7)則能改善脂質(zhì)和糖代謝[4]。這些研究表明了Ang-(1-7)可能在糖尿病患者中的心血管并發(fā)癥中扮演著重要的作用。近年來研究也表明了，Ang-(1-7)能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的損傷作用[5-7]，而其機(jī)制仍未完全明確。

ClC-3氯通道屬于電壓依賴性氯通道家族,普遍存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可作為容積調(diào)節(jié)性氯通道或Cl-/H+交換體參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的PH、容積、增殖、分化、遷移、凋亡等生理病理活動(dòng)。ClC-3氯通道于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能關(guān)系密切。與其參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[8]。但是，ClC-3氯通道是否參與高糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制尚未明確。

有研究者發(fā)現(xiàn)一種非凋亡性程序性死亡方式，具有規(guī)律性的調(diào)控機(jī)制，參與缺血性心臟血管疾病的發(fā)生，這種方式被命名為：壞死性凋亡(necroptosis，Nec)。Degterev等將Nec定義為：一種與壞死具有相似的形態(tài)學(xué)特征(包括包膜完整性破壞，細(xì)胞體積及胞內(nèi)細(xì)胞器腫脹)，但其細(xì)胞死亡方式為可調(diào)控的非caspase依賴性的程序性細(xì)胞死亡，即在caspase抑制的條件下，死亡受體與配體的結(jié)合可觸發(fā)壞死性凋亡。對(duì)Nec的研究是目前國際上極其活躍的前沿?zé)狳c(diǎn)。不斷增加的證據(jù)表明：Nec的誘導(dǎo)與阻截涉及機(jī)體自身穩(wěn)定、正常發(fā)育及多種疾病的發(fā)展與變化。Nec的特異性阻斷劑ncerostatin-1(Nec-1)可通過谷胱甘肽(GSH)、凋亡誘導(dǎo)因子和腺病毒E1B 19 kD-相關(guān)作用蛋白3(BNIP3)相關(guān)通路抑制谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。近來研究表明，Nec與高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷密切相關(guān)[9]。然而，Nec參與高糖引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制需要進(jìn)一步探討。

為此，本研究建立高糖損傷人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞模型，旨在探討: ( 1) ClC-3在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制; (2) Nec在高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制；(3)Ang-(1-7) 預(yù)處理能否通過通過調(diào)控ClC-3氯離子通道及Nec對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血管緊張素-(1-7)、NPPB、Nec-1、Hoechst33258和DCFH-DA購自Sigma; CCK-8試劑盒購自Dojindo; DMEM(低糖)培養(yǎng)基購自HyClone;胎牛血清(fetalbovine serum，F(xiàn)BS)購自 Gibco; ClC-3抗體、RIP3抗體和GAPDH 抗體購自 Proteintech; 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs) 購自廣州吉妮歐公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HUVEC的體外培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)在含10% FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基中，將HUVECs置于5% CO2、37 ℃的溫箱中培養(yǎng)。待HUVECs融合達(dá)80%后，用0.25% 胰蛋白酶-EDTA消化HUVECs，適度消化后加入完全培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的消化作用。用滅菌槍頭將瓶壁細(xì)胞吹落形成細(xì)胞懸液。于1200 r/min離心5min，棄上清，按1∶ 3傳代HUVECs。實(shí)驗(yàn)前換用無血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVECs 12 h，然后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為8組: (1)正常對(duì)照(control)組; (2)高糖(highglucose，HG) 組: 40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h; (3) Ang-(1-7)+HG組: 2 μmol/L Ang-(1-7)處理HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，接著應(yīng)用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h; (4) NPPB+ HG 組: 20 μmol/L NPPB處理HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，再用40 mmol/L葡萄糖作用HUVECs 24 h; (5)Nec-1+HG 組: 10 μmol/L Nec-1預(yù)處理HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，再用 40 mmol/L葡萄糖作用24 h; (6) Ang-(1-7)組: 2 μmol/L Ang-(1-7)作用于HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，再用DMEM培養(yǎng)基作用HUVECs 24 h; (7) NPPB組: 20 μmol/L NPPB作用于HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，再用DMEM培養(yǎng)基作用24 h; (8)Nec-1組:10 μmol/LNec-1作用于HUVECs 30 min，撤去培養(yǎng)液后用PBS洗3次，再用DMEM培養(yǎng)基處理HUVECs 24 h 。

1.4 CCK-8法實(shí)驗(yàn)測定HUVECs存活率

將HUVECs接種于96孔培養(yǎng)板中，待HUVECs 在培養(yǎng)孔內(nèi)生長至約80% 時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，于每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育24 h，使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(A)，波長設(shè)定為450 nm。按公式:HUVECs存活率(%) =處理組A/對(duì)照組A×100%，求出處理組細(xì)胞存活率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 Western blot法檢測ClC-3和RIP3的表達(dá)

將HUVECs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待HUVECs貼壁生長約80%時(shí)給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，各皿加入100 μL 裂解液后置4 ℃裂解40 min，于12 000 r/min離心15 min，取上清，蛋白濃度采用BCA法進(jìn)行測定。總蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉90 min，分別加入各種I抗[ClC-3和RIP3(1∶2500)]，4℃過夜，然后用TBST洗5次(每次10 min)，加入II抗(1∶10000)，室溫孵育60 min，然后再用TBST洗5次(每次10 min)。ECL發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。

1.6 SOD活性的檢測

將HUVECs接種于60 mm培養(yǎng)皿中，待HUVECs貼壁生長約80%時(shí)給予不同處理因素，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，各皿加入100 μL裂解液后置4 ℃裂解40 min，于12 000 r/min離15 min，取上清,采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，再將各樣品的總蛋白量調(diào)至相同。然后根據(jù)“Dojindo Lab. Japan”提供的SOD活性試劑盒說明書的操作步驟，檢測SOD對(duì)超氧化物的抑制率。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)含量的檢測

DCFH-DA是一種自身不能發(fā)熒光的化合物，可自由穿過細(xì)胞膜，被胞內(nèi) ROS氧化為有熒光的DCF。通過檢測DCF的熒光強(qiáng)度即可反映細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長貼壁生長至80%時(shí)，給予各實(shí)驗(yàn)組不同的處理因素后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗3次，將HUVECs與10 μmol/L DCFH-DA于37 ℃孵育30 min，再用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)地選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，采用ImageJ 1.41軟件分析各視野平均綠色熒光強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)每組的各個(gè)樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 線粒體膜電位的檢測

將HUVECs接種于96孔培養(yǎng)板中，待HUVECs在培養(yǎng)孔內(nèi)生長至約80%時(shí)，按照實(shí)驗(yàn)要求給予不同處理，棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗3次，用10 μg/L Rh123的無血清培養(yǎng)基于37 ℃溫箱中孵育60 min，然后用預(yù)冷的PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞核周圍綠色的亮點(diǎn)即為攝取了Rh123的線粒體。用Image J 1.47i軟件分析5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。重復(fù)5次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 血管緊張素-(1-7)抑制高糖上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ClC-3及RIP3表達(dá)水平

采用40 mmol/L葡萄糖分別處理HUVECs不同時(shí)間(0，6，12和24 h)后發(fā)現(xiàn)，40 mmol/L葡萄糖可顯著上調(diào)ClC-3及RIP3表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，其中在24 h時(shí)ClC-3及RIP3表達(dá)水均達(dá)到最高，見圖1 A-D。

應(yīng)用高糖(40mmol/L葡萄糖)處理HUVECs 24 h使ClC-3及RIP3表達(dá)水平升高，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。但是，在高糖處理血管內(nèi)皮細(xì)胞前，應(yīng)用2 μmol/L Ang-(1-7)預(yù)處理30 min使高糖對(duì)ClC-3及RIP3表達(dá)水平上調(diào)作用顯著減弱，與HG處理組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。2 μmol/L Ang-(1-7)本身對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞ClC-3及RIP3表達(dá)水平無明顯的影響，見圖1 E-H。

2.2 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1減輕HG引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的心肌細(xì)胞毒性

圖2顯示，采用40 mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h可以誘發(fā)心肌毒性作用，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞存活率降低，與對(duì)照組比較，差異顯著(P<0.01)。然而，2μmol·L-1Ang-(1-7)或20 μmol·L-1NPPB(ClC-3抑制劑)或10 μmol·L-1Nec-1與HG共處理心肌細(xì)胞24 h可明顯地減弱HG引起的心肌細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率升高，與HG組分別比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Ang-(1-7)或 NPPB或Nec-1本身不影響心肌細(xì)胞存活率(P>0.05,圖2)。

CLC-3GAPDHCLC-3/GAPDH******61224ConHighglucoseh**1.21.00.80.60.40.0CLC-3/GAPDH1.21.00.80.60.40.0RIP3GAPDH***61224ConHighglucoseh**$$CLC-3GAPDH1.21.00.80.60.40.0ConHGHGAng-(1-7)Ang-(1-7)$$ConHG**1.21.00.80.60.40.0GAPDHRIP3RIP3/GAPDHBCDEFGHAAng-(1-7)HGAng-(1-7)

圖1 血管緊張素-(1-7)抑制高糖上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞ClC-3及RIP3表達(dá)水平

2.3 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1減輕高糖引起的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激

HG作用于HUVECs 24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI；反映ROS水平的一個(gè)指標(biāo))明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。但經(jīng)2 μmol·L-1Ang-(1-7)或20 μmol·L-1NPPB(ClC-3抑制劑)或10 μmol·L-1Nec-1預(yù)處理HUVECs 30 min可使內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi) ROS堆積明顯減少，與高糖組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。而單獨(dú)2 μmol·L-1Ang-(1-7)或20 μmol·L-1NPPB(ClC-3抑制劑)或10 μmol·L-1Nec-1預(yù)處理則對(duì)胞內(nèi)ROS生成無明顯作用，見圖3。

120100806040200CellViability(%control)120100806040200CellViability(%control)ConHGHG-Ang(1-7)Ang-(1-7)HG+Nec-1ConHGHG+Ang-(1-7)Ang-(1-7)HG+NPPBNPPBNec-1**$$$$**$$$$AB

**P<0.01與對(duì)照組比較，$$P<0.01與HG組比較。

圖2 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1減輕HG引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的心肌細(xì)胞毒性

2.4 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1阻斷葡萄糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 SOD的抑制作用

圖4結(jié)果顯示,40mmol/L葡萄糖處理HUVECs 24 h,明顯抑制了SOD的活性，Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1本身對(duì)SOD活性無明顯的影響,但是能阻斷40 mmol/L葡萄糖對(duì)HUVECs的SOD的抑制作用,使SOD活性明顯增強(qiáng)。

2.5 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1減輕HG誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP丟失

圖5顯示，HG處理HUVECs 24 h后可使MMP明顯降低(圖5 Ab、Bb)，與對(duì)照組(圖5 Aa、Ba)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。但是，2 μmol·L-1Ang-(1-7)或 20 μmol·L-1NPPB(ClC-3抑制劑)或10 μmol·L-1Nec-1與HG共處理HUVECs 24 h后可使MMP降低減少，與HG組分別比較，差異顯著(P<0.01)。

**$$$$20151050MFIofROSConHGHG+Ang-(1-7)Ang-(1-7)HG+NPPBNPPB**$$$$20151050MFIofROSConHGHG-Ang(1-7)Ang-(1-7)HG+Nec-1Nec-1AB

**P<0.01與對(duì)照組比較，$$P<0.01與HG組比較。

圖3 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1減輕HG誘發(fā)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激

3 討論

與我們以往報(bào)道相一致[13]，本研究在HG處理血管內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，再次證實(shí)HG能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)多種損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率降低(細(xì)胞毒性作用)，SOD生成下降和ROS(氧化應(yīng)激)生成增多及MMP丟失(線粒體受損)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)觀察到HG能明顯促進(jìn)ClC-3的表達(dá)，提示HG能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞ClC-3氯離子通道。而ClC-3氯通道于血管內(nèi)皮細(xì)胞功能關(guān)系密切。與其參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等密切相關(guān)[8，11]。

ConHGHG-Ang(1-7)Ang-(1-7)HG+Nec-1Nec-1ConHGHG+Ang-(1-7)Ang-(1-7)HG+NPPBNPPB$$$$**$$$$**100806040200Inhibition(%)100806040200Inhibition(%)AB

**P<0.01與對(duì)照組比較，$$P<0.01與HG組比較。

圖4 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1阻斷葡萄糖對(duì) SOD的抑制作用

支持本文的研究結(jié)果。為了進(jìn)一步證實(shí)ClC-3氯離子通道在HG損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，我們觀察了ClC-3離子通道抑制劑NPPB對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。研究結(jié)果表明，NPPB能顯著地減輕HG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種損傷作用，表現(xiàn)為使細(xì)胞存活率升高，SOD生成增加、ROS生成及MMP丟失減少等，清晰地提示ClC-3離子通道介導(dǎo)HG引起的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激及線粒體損傷等作用。

此外，我們研究小組還觀察到，HG能明顯促進(jìn)RIP3的表達(dá)，提示HG能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞Nec。Liang GZ,等研究表明Nec-1可通過抑制β-catenin通路保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用[8]，提示Nec在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中扮演重要作用。為了驗(yàn)證Nec在HG損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用，我們觀察了Nec抑制劑Nec-1對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響。與NPPB作用類似，Nec-1同樣能減輕HG對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的多種損傷作用。我們的研究結(jié)果提示Nec介導(dǎo)HG引起的細(xì)胞毒性、氧化應(yīng)激及線粒體損傷等作用。

Ang-(1-7)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中具有與Ang-II相反的多種生理作用，其中研究表明Ang-(1-7)具有血管內(nèi)皮保護(hù)[14]。而在糖尿病導(dǎo)致的心血管并發(fā)癥中，Ang-(1-7)的血管內(nèi)皮保護(hù)作用使得其成為防治糖尿病心血管損傷的熱點(diǎn)之一。既往研究表明，Ang-(1-7)能保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的損傷作用[5-7]，然而其機(jī)制仍未完全明確，Ang-(1-7)能否通過調(diào)控ClC-3氯離子通道及Nec對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚未見報(bào)道。本研究證實(shí)，外源性Ang-(1-7)能抑制HG對(duì)ClC-3及RIP3的激活；ClC-3抑制劑NPPB及Nec-1抑制劑Nec-1均能產(chǎn)生類似于Ang-(1-7)的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，進(jìn)一步提示通過抑制ClC-3氯離子通道及Nec可能是Ang-(1-7)保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗HG引起的損傷的重要機(jī)制之一。由于離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可能與在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果存在一些差異，因此，本研究擬在今后在糖尿病動(dòng)物模型，開展進(jìn)一步的研究。

$$**$$$$$$**403020100MFIofMMPConHGHG+Ang-(1-7)Ang-(1-7)HG+NPPBNPPB403020100MFIofMMPConHGHG-Ang(1-7)Ang-(1-7)HG+Nec-1Nec-1AB

**P<0.01與對(duì)照組比較，$$P<0.01與HG組比較。

圖5 Ang-(1-7) 、NPPB及Nec-1抑制HG引起的HUVECs MMP降低