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    雞血漿中磺胺氯吡嗪鈉和甲氧芐啶含量HPLC檢測方法的建立

    2019-11-11 12:27:18卓國榮王東亮陳鴻雨卜仕金張明珠楊海峰孫晨明
    中國獸藥雜志 2019年10期
    關(guān)鍵詞:吡嗪工作液磺胺

    卓國榮,聶 巧,王東亮,陳鴻雨,秦 琪,卜仕金,3*,張明珠,楊海峰,孫晨明

    (1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚州 225009; 2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院,江蘇泰州 225300; 3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚州 225009)

    磺胺氯吡嗪鈉(SPZ)屬于磺胺類抗菌藥,常用于雞球蟲病的治療[1-2],也用于球蟲病爆發(fā)時繼發(fā)的細菌病(禽傷寒、禽霍亂)防治[3];甲氧芐啶(TMP)是目前國內(nèi)常用的磺胺抗菌增效劑,屬于二氨基嘧啶類化學(xué)合成抗菌藥,與磺胺類藥物合用可使磺胺類藥物抗菌抗菌活性大大增強[4],從而可以解決目前臨床中磺胺氯吡嗪鈉單方應(yīng)用時逐漸增加的耐藥性問題。本試驗建立雞血漿中磺胺氯吡嗪-甲氧芐啶含量測定的HPLC法,對開展磺胺氯吡嗪鈉-甲氧芐啶可溶性粉在雞體內(nèi)的藥動學(xué)和生物利用度研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 對照品 磺胺氯吡嗪鈉(分子式C10H8N4O2ClNaS·H2O)對照品:含量為99.0%(以磺胺氯吡嗪鈉計),0.1 g/棕色絲口玻璃瓶,批號40908,購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。使用前無需干燥處理。甲氧芐啶(分子式C14H18N4O3)對照品:含量為99.9%(以甲氧芐啶計),100 mg/安剖瓶,批號100031-201405,購自中國食品藥品檢定研究院。使用前無需干燥處理。

    1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純,購自美國TEDIA公司。磷酸二氫鉀為分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    1.3 試液的配制

    1.3.1 0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液 準確稱取2.7218 g磷酸二氫鉀,用1000 mL超純水定容并混勻,即制得0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液。

    1.3.2 20%甲醇溶液 將甲醇和超純水按20∶80(V/V)比例混勻,經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾,超聲脫氣20 min即可?,F(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.3.3 磺胺氯吡嗪儲備液 精密稱取磺胺氯吡嗪鈉對照品約28.9 mg于25 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,即配成濃度為1000 μg/mL的磺胺氯吡嗪標準儲備液。置-20 ℃冷凍保存。

    1.3.4 甲氧芐啶儲備液 精密稱取甲氧芐啶對照品約25.0 mg于25 mL量瓶中,用乙腈溶解定容并超聲助溶,即配成濃度為1000 μg/mL的甲氧芐啶標準儲備液。置-20 ℃冷凍保存。

    1.3.5 混合標準工作液 分別準確吸取適量磺胺氯吡嗪儲備液和甲氧芐啶標準儲備液,用20%甲醇溶液稀釋使磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度分別為1、5、20、50、100、200、700 μg/mL和0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL?,F(xiàn)配現(xiàn)用。

    1.4 血漿樣品制備 試驗采用黃羽肉雞,購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所,出殼后飼養(yǎng)在嚴格消毒的雞籠內(nèi),至35日齡時從翅下靜脈采血,血樣置于肝素浸潤并烘干的離心管內(nèi),3500 r/min,離心10 min,-20 ℃冷凍備用。

    1.5 儀器及設(shè)備 高效液相色譜儀,Agilent 1260型高效液相色譜儀,配有紫外檢測器和色譜工作站,Agilent公司;色譜柱,Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm,5 μm),Agilent公司;UPH-11-20T型優(yōu)普超純水制造系統(tǒng),成都超純科技有限公司;N-EVAPTM112型干浴氮吹儀,美國Organomation公司;電子分析水平,感量0.0001 g,德國塞多利斯天平公司;PB-10型PH計,德國塞多利斯天平公司;KS-250D超聲儀,寧波科生儀器廠;WH-1微型漩渦混合儀,上海滬西分析儀器廠有限公司;5810-R型高速冷凍離心機,德國eppendorf股份公司;可調(diào)微量移液器,10~100、20~200、100~1000 μL,德國eppendorf股份公司;10 mL指形管,揚子化工玻璃儀器有限公司;1.5 mL指形管,美國Axygen公司。

    2 方法

    2.1 血漿樣品前處理 準確吸取室溫下解凍后的血漿樣品200 μL置于1.5 mL指形管中,加入1 mL乙腈渦旋振蕩3 min后,離心10 min(4 ℃,14000 r/min),將上清液移至10 mL指形管中。殘渣加1 mL乙腈渦旋振蕩3 min,離心10 min(4 ℃,14000 r/min),合并上清液。取上清液于40 ℃干浴氮氣吹干后,加入20%甲醇溶液200 μL溶解,渦旋振蕩3 min。將復(fù)溶后的溶液移至1.5 mL指形管內(nèi),離心10 min(4 ℃,14000 r/min),取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾,濾液供HPLC分析。

    2.2 色譜條件 色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(250×4.6 mm,5 μm);流動相: A相,甲醇;B相,0.02 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(表1);流速:1.0 mL/min;柱溫:35 ℃;進樣量:20 μL; 紫外檢測波長:0 ~ 13.5 min,λ1=240 nm(甲氧芐啶);13.5 ~ 21 min,λ2=268 nm(磺胺氯吡嗪)。

    2.3 標準曲線和線性范圍 分別準確吸取180 μL室溫解凍的空白血漿于7支1.5 mL指形管中,并依次分別加入對應(yīng)濃度的磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶混合標準工作液20 μL,渦旋30 s混勻,使磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度分別為0.1、0.5、2、5、10、20、70 μg/mL和0.05、0.10、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL。即制得以上系列磺胺氯吡嗪、甲氧芐啶空白血漿添加濃度。將上述樣品按照2.1項下的血漿樣品處理方法處理后,進行HPLC分析。外標法定量,以磺胺氯吡嗪(As)和甲氧芐啶(As)對各自的血藥濃度(C)分別進行線性回歸,得回歸方程。共作3次平行試驗。

    表1 流動相梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of mobile phase

    2.4 定量限(LOQ)和檢測限(LOD) 分別將含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.5、1.0、5.0 μg/mL和0.25、0.50、1.00 μg/mL混合標準工作液20 μL加入180 μL空白血漿中,渦旋混勻后制得血漿樣品中分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的濃度為0.05、0.10、0.50 μg/mL和0.025、0.050、0.100 μg/mL,每個濃度制備5個平行樣品。依據(jù)2.1項下的血漿樣品處理方法處理,上清液供HPLC分析,測得各樣品的峰高與噪音(基線峰高)。取信噪比S/N≥3時濃度為檢測限(LOD);取信噪比S/N≥10,且結(jié)合精密度和準確度試驗結(jié)果確定定量限(LOQ)。

    2.5 回收率 取1.5 mL指形管數(shù)支,按照2.3項標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標準曲線,每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后,取上清液20 μL作HPLC分析。分別將測得磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的峰面積(As),代入當天的各自的標準曲線求得實測濃度。實測濃度與添加濃度之比值乘以百分數(shù)即為相對回收率。

    2.6 精密度 取1.5 mL指形管數(shù)支,按照2.3項標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、70.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品及一條隨行標準曲線,每批每個濃度制備5份平行樣品,連續(xù)3 d,共作三個批次。按2.1項下血漿樣品處理方法操作。分別將測得磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的峰面積(As),代入當天的各自的標準曲線得到實測濃度,據(jù)此分別計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

    2.7 穩(wěn)定性

    2.7.1 儲備液的穩(wěn)定性 按1.3.5項混合標準工作液制備方法,制備含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三個濃度混合標準工作液,每個濃度制備5個平行。制備后立刻對樣品進行分析,得到第0時數(shù)據(jù)。之后將兩種儲備液分別于凍存(約-20 ℃)30、60、90 d后按上述方法配制并進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較考察儲備液貯存期間的穩(wěn)定性。

    2.7.2 樣品室溫放置下的穩(wěn)定性 按照2.3項下標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品,每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后,立刻取上清液20 μL作HPLC分析,得到第0時數(shù)據(jù);之后在室溫(約22 ℃)下分別放置2、6、8 h后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較,考察樣品室溫放置時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的穩(wěn)定性。

    2.7.3 樣品反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性 按照2.3項下標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品,每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后,立刻取上清液20 μL作HPLC分析,得到第0時數(shù)據(jù);在-20 ℃下至少儲存一天后取出解凍,之后再次冷凍、解凍,反復(fù)共進行3次凍融循環(huán)處理。兩次凍融間隔時間至少為5 h。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較,考察反復(fù)凍融下樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的穩(wěn)定性。

    2.7.4 樣品凍存期間的穩(wěn)定性 按照2.3項下標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加樣品,每個濃度制備5個平行樣品。按2.1項下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后,立刻取上清液20 μL作HPLC分析,得到第0時數(shù)據(jù);之后分別于凍存(約-20 ℃)10、20、40 d后進行樣品分析。通過與0時測定的數(shù)據(jù)比較,考察樣品貯存期間的穩(wěn)定性。

    2.8 干擾性

    2.8.1 混合標準工作液的干擾性 按1.3.5項下混合標準工作液制備方法,制備2 mL含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL的三個濃度混合標準工作液;準確吸取適量磺胺氯吡嗪標準儲備液,用20%甲醇溶液稀釋使磺胺氯吡嗪的濃度分別為0.1、2.0、20.0 μg/mL;準確吸取適量甲氧芐啶標準儲備液,用20%甲醇溶液稀釋使甲氧芐啶的濃度分別為0.05、0.50、5.00 μg/mL。每個濃度制備5個平行。

    上述標準工作液制備后取20 μL于2.2項下色譜條件下作HPLC分析。通過相同濃度的混合標準品與單一磺胺氯吡嗪或甲氧芐啶標準品測定的數(shù)據(jù)比較,考察混合標準工作液中同時存在磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶時,對彼此測定結(jié)果的干擾性影響。

    2.8.2 空白血漿添加樣品的干擾性 按照2.3項下標準曲線制備方法制備分別含磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶0.1、2.0、20.0 μg/mL和0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加磺胺氯吡嗪-甲氧芐啶樣品;取20 μL經(jīng)20%甲醇溶液稀釋至1、2、20 μg/mL濃度的磺胺氯吡嗪標準工作液,添加至180 μL空白血漿中,制備0.1、2.0、20.0 μg/mL三個濃度的空白血漿添加磺胺氯吡嗪樣品;取20 μL經(jīng)20%甲醇溶液稀釋至0.5、5.0、50.0 μg/mL濃度的甲氧芐啶標準工作液,添加至180 μL空白血漿中,制備0.05、0.50、5.00 μg/mL三個濃度的空白血漿添加甲氧芐啶樣品。每個濃度制備5個平行樣品。

    將上述樣品按2.1項下的血漿樣品預(yù)處理方法處理后,取上清液20 μL于2.2項下色譜條件下作HPLC分析。通過血漿添加相同濃度的混合標準品與單一磺胺氯吡嗪或甲氧芐啶測定的數(shù)據(jù)比較,考察樣品中同時存在磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶時對彼此測定結(jié)果的干擾性影響。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶血漿樣品測定的色譜圖 磺胺氯吡嗪標準品和甲氧芐啶混合標準品、空白血漿及空白血漿添加甲氧芐啶混合標準品色譜分析圖分別見圖1~圖5。在本試驗建立的色譜條件下,磺胺氯吡嗪出峰時間在14.9 min左右,甲氧芐啶出峰時間在9.1 min左右,且待測組分與溶劑峰及血漿中其他基質(zhì)組分能完全分開。

    圖1 磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧芐啶(0.025 μg/mL)混合標準品色譜圖Fig 1 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

    圖2 空白血漿色譜圖Fig.2 Chromatogram of blank plasma

    圖3 空白血漿添加磺胺氯吡嗪(0.05 μg/mL)和甲氧芐啶(0.025 μg/mL)樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of blank plasma added with SPZ (0.05 μg/mL) and TMP (0.025 μg/mL)

    圖4 磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧芐啶(0.05 μg/mL)混合標準品色譜圖Fig 4 Chromatogram of Standard Mixtures of SPZ(0.1 μg/mL)and TMP (0.05 μg/mL)

    圖5 空白血漿添加磺胺氯吡嗪(0.1 μg/mL)和甲氧芐啶(0.05 μg/mL)樣品色譜圖Fig 5 Chromatogram of blank Plasma added with SPZ(0.1 μg/mL) and TMP (0.05 μg/mL)

    3.2 標準曲線及線性范圍

    3.2.1 磺胺氯吡嗪標準曲線及線性范圍 磺胺氯吡嗪的血漿藥物濃度在0.1~70.00 μg/mL范圍內(nèi),血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系(R2=1.0000)。結(jié)果見表2。以血藥濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制的標準曲線見圖6。

    表2 磺胺氯吡嗪標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 2 Linear regression equation and correlationcoefficient of SPZ

    圖6 磺胺氯吡嗪標準曲線圖Fig 6 Standard working curve of SPZ

    3.2.2 甲氧芐啶標準曲線及線性范圍 甲氧芐啶的血漿藥物濃度在0.05~5.00 μg/mL范圍內(nèi),血漿藥物濃度與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.9999)。結(jié)果見表3。以血藥濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制的標準曲線見圖7。

    表3 甲氧芐啶標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Tab 3 Linear regression equation and correlationcoefficient of TMP

    圖7 甲氧芐啶標準曲線圖Fig 7 Standard working curve of TMP

    3.3 檢測限和定量限 取信噪比S/N≥3時的濃度為最低檢測限,信噪比S/N≥10時的濃度為定量限。根據(jù)檢測得,該方法磺胺氯吡嗪的檢測限為0.05 μg/mL,定量限為0.1 μg/mL;甲氧芐啶的檢測限為0.025 μg/mL,定量限為0.05 μg/mL。

    3.4 回收率 在空白血漿添加樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的回收率測定結(jié)果分別見表4和表5。由表4可見,磺胺氯吡嗪空白血漿添加水平在0.1~70.0 μg/mL時,回收率在92%~104%之間;由表5可見,甲氧芐啶空白血漿添加水平在0.05~5.00 μg/mL時,回收率在91%~96%之間。

    表4 空白血漿添加磺胺氯吡嗪樣品相對回收率(%)(n=5)Tab 4 Relative recoveries of SPZ in blank plasma (%) (n = 5)

    表5 空白血漿添加甲氧芐啶樣品相對回收率(%)(n=5)Tab 5 Relative recoveries of TMP in blank plasma (%) (n = 5)

    3.5 精密度 在空白血漿添加樣品中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的批內(nèi)和批間精密度測定結(jié)果分別見表6和表7。由表6可見,磺胺氯吡嗪空白血漿添加水平在0.1~70.0 μg/mL時,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于6.61%和5.18%;由表7可見,甲氧芐啶空白血漿添加水平在0.05~5.00 μg/mL時,批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別小于6.89%和6.84%。

    3.6 穩(wěn)定性

    3.6.1 儲備液存儲期間的穩(wěn)定性 磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶儲備液穩(wěn)定性試驗結(jié)果分別見表8和表9。結(jié)果表明,磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶儲備液于-20 ℃條件下凍存能夠保持穩(wěn)定達90 d。

    表6 空白血漿添加磺胺氯吡嗪精密度測定結(jié)果Tab 6 Precision determination of SPZ in blank plasma

    n.樣本數(shù);RSD. 變異系數(shù).

    表7 空白血漿添加甲氧芐啶精密度測定結(jié)果Tab 7 Precision determination of TMP in blank plasma

    表8 磺胺氯吡嗪儲備液在-20 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 8 The stability of SPZ stock solutions stored at -20℃(n=20)

    表9 甲氧芐啶儲備液在-20 ℃貯存條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 9 The stability of TMP stock solutions stored at -20℃(n=20)

    3.6.2 室溫放置下的穩(wěn)定性 室溫放置下樣品的穩(wěn)定性測定結(jié)果分別見表10和表11。結(jié)果表明,雞血漿樣品在室溫條件(約22 ℃)下放置時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶均可保持穩(wěn)定達8 h。

    表10 空白血漿添加樣品放置室溫(+22 ℃)下磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 10 The stability of SPZ in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

    表11 空白血漿添加樣品放置室溫(+22 ℃)下甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 11 The stability of TMP in blank plasma at room temperature (+22℃) (n=20)

    3.6.3 反復(fù)凍融下的穩(wěn)定性 血漿樣品反復(fù)凍融條件下的穩(wěn)定性測定結(jié)果見表12和表13。結(jié)果表明,雞血漿樣品經(jīng)三個循環(huán)凍融后其磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶仍能保持較好的穩(wěn)定性。

    表12 空白血漿添加樣品經(jīng)三個凍融循環(huán)(+22 ℃/-20 ℃)后磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 12 The stability of SPZ in blank plasma after three freeze-thaw cycles(+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

    表13 空白血漿添加樣品經(jīng)三個凍融循環(huán)(+22 ℃/-20 ℃)后甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 13 The stability of TMP in blank plasma after three freeze-thaw cycles (+22 ℃/-20 ℃)(n=20)

    3.6.4 樣品存儲期間的穩(wěn)定性 樣品存儲期間穩(wěn)定性測定結(jié)果見表14和表15。結(jié)果表明,血漿樣品于-20 ℃條件下凍存時磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶能夠保持穩(wěn)定達40 d。

    表14 空白血漿添加樣品在-20 ℃凍存條件下磺胺氯吡嗪的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 14 The stability of SPZ in blank plasma after storing at -20 ℃(n=20)

    表15 空白血漿添加樣品在-20 ℃凍存條件下甲氧芐啶的穩(wěn)定性測定結(jié)果(n=20)Tab 15 The stability of TMP in blank plasma after storing at -20℃(n=20)

    3.7 干擾性

    3.7.1 混合標準工作液的干擾性 混合標準工作液的干擾性試驗測定結(jié)果見表16。結(jié)果表明,磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶在2.2項的色譜條件下測定兩者之間不會產(chǎn)生相互干擾。

    表16 磺胺氯吡嗪標準工作液與甲氧芐啶標準工作液之間的干擾性試驗測定結(jié)果(n=10)Tab 16 Interference test results between standard working fluid of SPZ and standard working fluid of TMP(n=10)

    3.7.2 空白血漿添加樣品的干擾性 空白血漿添加磺胺氯吡嗪與甲氧芐啶樣品,兩者之間的干擾性試驗測定結(jié)果見表17。結(jié)果表明,兩者之間的出峰時間及實測濃度均不會產(chǎn)生相互干擾現(xiàn)象。

    表17 空白血漿添加磺胺氯吡嗪與甲氧芐啶樣品的出峰時間干擾性試驗測定結(jié)果(n=10)Tab 17 The results of interferential test of peak time of SPZ and TMP in blank plasma (n=10)

    4 討 論

    4.1 確定磺胺氯吡嗪的紫外檢測波長 分別將0.5、1、2 μg/mL的磺胺氯吡嗪標準工作液20 μL加入180 μL空白血漿中,渦旋混勻后分別制得0.05、0.1、0.2 μg/mL三個磺胺氯吡嗪空白添加血漿濃度。依據(jù)2.1項下的血漿樣品處理方法處理后,設(shè)置DAD為200~400 nm全波長掃描(步進值為2 nm),按2.2項下的色譜條件進行HPLC光譜分析。每個濃度重復(fù)3次,確定磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波長和最佳檢測波長。

    在2.2項建立的色譜條件下,磺胺氯吡嗪最大紫外吸收波長為268 nm,且僅在此檢測波長下磺胺氯吡嗪檢測限能夠達到0.05 μg/mL,故本試驗采用268 nm為磺胺氯吡嗪的紫外檢測波長。

    4.2 確定甲氧芐啶的紫外檢測波長 分別將0.25、0.5、1 μg/mL的甲氧芐啶標準工作液20 μL加入180 μL空白血漿中,渦旋混勻后分別制得0.025、0.05、0.1 μg/mL三個甲氧芐啶空白添加血漿濃度。依據(jù)2.1項下的血漿樣品處理方法處理后,設(shè)置DAD為200~400 nm全波長掃描(步進值為2 nm),按2.2項下的色譜條件進行HPLC光譜分析。每個濃度重復(fù)3次,確定甲氧芐啶最大紫外吸收波長和最佳檢測波長。在2.2項建立的色譜條件下,甲氧芐啶最大紫外吸收波長為200 nm,但在該條件下經(jīng)過檢測器的其他物質(zhì)也有很大吸收,綜合考慮選擇240 nm作為甲氧芐啶的檢測波長,且在此檢測波長下甲氧芐啶檢測限能夠達到0.025 μg/mL,故本試驗采用240 nm為甲氧芐啶的紫外檢測波長。

    4.3 血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的提取方法 研究表明在對血樣進行處理時主要使用乙腈[5-7]、乙酸乙酯[8]、無水乙醇[9]、10%高氯酸[10]。在血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的提取方法研究中,試驗先后用1 mL純甲醇、1 mL乙腈、1mL乙腈-異丙醇(4 ∶1)、1mL乙腈-甲醇(4 ∶1)4種方法萃取藥物,發(fā)現(xiàn)甲醇提取時雜質(zhì)干擾嚴重,其余三種方法兩種藥物回收率均在80%以上,純乙腈提取較其他組回收率高且雜質(zhì)較少。又繼續(xù)比較了以1 mL乙腈提取一次和提取兩次,發(fā)現(xiàn)兩次提取時兩種藥物的回收率均較一次提取回收率高且均無雜質(zhì)干擾藥峰,故選擇提取方法為用1 mL乙腈提取兩次。

    4.4 血漿中磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶含量的測定方法 在本試驗建立的測定磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶色譜條件下,以安捷倫1260進行DAD全波長掃描,發(fā)現(xiàn)磺胺氯吡嗪在268 nm紫外檢測波長處有最大吸收,甲氧芐啶最大紫外吸收波長為200 nm,但在該條件下經(jīng)過檢測器的其他物質(zhì)也有很大吸收,綜合考慮選擇240 nm作為甲氧芐啶的檢測波長。研究發(fā)現(xiàn)當柱溫為室溫或30 ℃時,雜峰干擾甲氧芐啶藥物峰,當溫度為35 ℃時,甲氧芐啶藥峰與雜峰完全分離。研究表明流動相用甲醇和水時,藥物保留時間不穩(wěn)定,當流動相中加入磷酸二氫鉀時藥物保留時間穩(wěn)定,將有機相換成乙腈時基線向下漂移。多次試驗發(fā)現(xiàn)用流動相溶解氮吹后的殘渣會導(dǎo)致磺胺氯吡嗪析出,而更換純甲醇會導(dǎo)致磺胺氯吡嗪出現(xiàn)前沿峰、甲氧芐啶裂峰,將其更換為甲醇和水的混合溶液時藥物峰面積和保留時間穩(wěn)定。比較甲醇和水體積比分別為80∶20、70∶30、50∶50、30∶70、20∶80對藥物檢測靈敏度的影響,研究表明甲醇和水的體積比為20∶80時對兩種藥物的檢測靈明度均最高,因此,選用甲醇水(20∶80,V/V)溶解氮吹后的殘渣。參考孫晨明[5]的研究,本實驗采用梯度洗脫有效改善峰形且縮短兩藥物出峰時間差,同時采用雙波長檢測降低甲氧芐啶的檢測限和定量限,提高靈敏度。當前色譜條件下,磺胺氯吡嗪出峰時間為14.9 min左右,甲氧芐啶出峰時間為9.1 min左右,待測藥物磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶均能夠在圖譜上呈現(xiàn)較好的峰形,與其他雜質(zhì)峰分離開,并且能夠準確定量。

    5 結(jié) 論

    在本試驗所建立的HPLC條件下,空白血漿添加磺胺氯吡嗪、甲氧芐啶分別在0.1~70.0 μg/mL和0.05~5.00 μg/mL范圍內(nèi),藥物濃度與檢測器響應(yīng)值之間相關(guān)性良好(R2= 0.9999);回收率分別在92% ~ 103%和91% ~ 96%之間;批內(nèi)系數(shù)分別小于6.62%和5.18%,批間系數(shù)分別小于6.89%和6.84%。該方法磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的檢測限分別為0.05 μg/mL和0.025 μg/mL,定量限分別為0.1 μg/mL和0.05 μg/mL。

    本試驗所建立的反相高效液相色譜-紫外檢測法,分析成本低,操作便捷,檢測迅速,方法的靈敏度、準確性和重現(xiàn)性均能滿足磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶的單獨或同時血藥濃度檢測需求,能夠為進一步的磺胺氯吡嗪和甲氧芐啶藥動學(xué)研究和生物利用度研究提供依據(jù),從而對臨床合理用藥和抗球蟲藥物新制劑的研發(fā)提供指導(dǎo)。

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