湖南桃江稻瘟病菌遺傳多樣性分析及無(wú)毒基因的鑒定

賀 雄，丁朝輝，周 瑚,3，朱華珺,3，李俊俊，丁宇倩，胡立冬，任佐華，劉二明,3*

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 湖南 長(zhǎng)沙 410128; 2. 植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南 長(zhǎng)沙 410128; 3. 南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南 長(zhǎng)沙 410128; 4. 湖南省桃江縣農(nóng)業(yè)局植保植檢站, 湖南 桃江 413400)

【研究意義】水稻稻瘟病(Rice blast)又名稻熱病，俗稱吊頭瘟、火燒瘟、掐頸瘟，是危害水稻的三大病害之一。稻瘟病是由稻瘟病菌(有性世代Magnaportheoryzae，無(wú)性世代Pyriculariaoryzae)引起，能侵染水稻各個(gè)生育期的組織，也可以寄生在小麥、大麥和粟等多種禾本科作物及雜草上[1]。我國(guó)稻瘟病年平均發(fā)生面積為380萬(wàn)hm2，而湖南稻瘟病常年發(fā)生危害面積為35萬(wàn)hm2，流行年份損失稻谷兩億千克以上[2]，因此稻瘟病分布的廣泛性和危害性受到政府和科學(xué)家的廣泛關(guān)注。選育和推廣水稻抗性品種是防止稻瘟病流行和危害最經(jīng)濟(jì)、有效的策略，由于大面積推廣種植單一品種所形成的選擇壓導(dǎo)致稻瘟病菌極易產(chǎn)生新的生理小種和毒性類型，從而使抗病水稻品種在推廣種植3～5年后抗性降低甚至直接喪失抗性[3]。因此，深入了解病菌的遺傳結(jié)構(gòu)組成和無(wú)毒基因變化趨勢(shì)，對(duì)抗病品種選育及合理布局至關(guān)重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，我國(guó)多個(gè)稻區(qū)稻瘟病發(fā)生頻率持續(xù)增高，筆者所在實(shí)驗(yàn)室多年來(lái)對(duì)湖南稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)及無(wú)毒基因動(dòng)態(tài)變化有持續(xù)研究。發(fā)現(xiàn)麗江新團(tuán)黑谷上的稻瘟病菌遺傳具有明顯的多樣性，且其無(wú)毒基因的變異率正在逐年增高[4-5]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究在已有的研究基礎(chǔ)上，于2017年從湖南桃江稻瘟病病圃采集了多個(gè)晚稻品種的稻瘟病標(biāo)樣，經(jīng)單包分離、純化，利用SSR分子標(biāo)記方法，分析了這些稻瘟病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性；通過(guò)無(wú)毒基因的鑒定對(duì)稻瘟病菌的致病能力以及無(wú)毒基因組成和分布進(jìn)行了分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究結(jié)果將為湖南稻區(qū)選育和推廣水稻稻瘟病抗性品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 SSR遺傳多樣性分析

1.1.1 供試菌株 本試驗(yàn)供試稻瘟病菌株共29個(gè)，于2017年采自湖南省益陽(yáng)市桃江縣稻瘟病圃(N 28°22′，E 112°03′)中多個(gè)主栽水稻品種的葉瘟和穗頸瘟感病標(biāo)樣，經(jīng)單孢分離技術(shù)[6]獲得(表1)。

1.1.2 稻瘟病菌富集培養(yǎng) 將保存在高粱粒中的稻瘟病菌接種到可溶性淀粉固體平板培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至稻瘟病菌菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板，在體式顯微鏡下用接種針從平板外緣挑取少量附有培養(yǎng)基的菌絲接種到盛有50 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃下180 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3～5 d。

1.1.3 DNA提取及檢測(cè) 采用試劑盒法(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取稻瘟病菌基因組DNA。

表1 供試稻瘟病菌菌株

表2 供試SSR引物

使用Nano Drop的Spectrophotometer檢測(cè)樣品DNA的純度和濃度(純DNA：OD260/OD280≈1.8，正常；>1.9，表明有RNA污染；<1.6表明有蛋白質(zhì)、酚等污染)，并調(diào)整DNA純度為150 ng/μl[7]。

1.1.4 PCR擴(kuò)增 8對(duì)SSR引物：KMS02、SMS17、G5、FG01、FG02、FG03、MS355、MS677，上海生工公司(表2)。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋孩僖颣MS02、SMS17、G5的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2.5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。②引物FG01、FG02、FG03的反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。③引物MS355、MS677的反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.1.5 瓊脂糖凝膠電泳 利用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。第1孔加入由3 μl Green I染料和7 μl marker制成的混合液8 μl；第2孔加由3 μl染料、2 μl Loading Buffer和5 μl ddH2O制成的混合液8 μl；第3至第25孔分別加入由3 μl染料、2 μl Loading Buffer及5 μl PCR產(chǎn)物混合而成的上樣液8 μl。在110 V電壓強(qiáng)度下，電泳約35 min，條帶遷移至凝膠的1/2～2/3處即可。電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)凝膠進(jìn)行觀察、拍照記錄。

表3 PCR擴(kuò)增體系

將SSR引物擴(kuò)增電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制數(shù)據(jù)，即有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，采用DPS 7.05軟件Nei & Li最長(zhǎng)距離法進(jìn)行聚類分析。

1.2 無(wú)毒基因鑒定

1.2.1 供試材料 供試水稻：普感稻瘟病品種麗江新團(tuán)黑谷(LTH)和國(guó)際水稻所培育的22個(gè)水稻抗稻瘟病近等基因系(NILs)原種由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)彭友良教授提供，現(xiàn)由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存和繁殖。

供試菌株：2017年在湖南省益陽(yáng)市桃江縣稻瘟病圃采樣分離純化的1～19號(hào)菌株。

1.2.2 離體接種 將供試的水稻種子浸種至露白，播于育苗盆中，以LTH作為感病對(duì)照，每盆播種4個(gè)不同的品種。在水稻1葉1心、3葉1心期各追施一次氮肥，待長(zhǎng)至5葉期剪取葉片，參照馬軍濤[8]方法進(jìn)行針刺離體接種，接種稻瘟病菌株孢子懸浮液濃度為2×100個(gè)/mL(含0.025 % Tween20)。接種后的稻苗置于28 ℃、RH為95 %的環(huán)境中暗處理24 h，隨后光暗交替(L/D = 12 h/12 h)培養(yǎng)，期間隨時(shí)觀察發(fā)病情況，4～6 d后記錄發(fā)病情況。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù) 當(dāng)接種葉段僅有黑褐色壞死斑或沒有病斑時(shí)為抗病反應(yīng)型記為R(圖2)；當(dāng)病斑中央灰白色、病斑較大且有黃色暈圈時(shí)為感病反應(yīng)型，記為S(圖3)。

圖1 抗病R型

稻瘟病菌群體的毒力頻率(virulence frequency，VF %) = 對(duì)測(cè)試水稻品種有毒力的菌株數(shù)/所有菌種菌株數(shù)×100 %；當(dāng)VF≥70 %時(shí)為病菌群體表現(xiàn)強(qiáng)毒力，50 %≤VF<70 %時(shí)為較強(qiáng)毒力，20 %

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物對(duì)供試菌株的擴(kuò)增

不同水稻品種上分離出來(lái)的29個(gè)供試菌株和8對(duì)用于分析的SSR引物反應(yīng)體系均能有效擴(kuò)增，且不同引物對(duì)供試菌株的擴(kuò)增多態(tài)性不同。G5、SMS17、KMS02、FG01、FG02、FG03、MS355、MS677分別擴(kuò)增出18、22、26、25、22、18、16和23條亮帶，且重復(fù)性良好，陰性對(duì)照無(wú)任何譜帶出現(xiàn)(圖3)。

2.2 桃江地區(qū)侵染不同水稻品種的稻瘟病菌群體遺傳譜系

利用8對(duì)SSR引物對(duì)侵染不同水稻品種的29個(gè)稻瘟病菌單孢菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的電泳結(jié)果轉(zhuǎn)換為0-1數(shù)據(jù)，通過(guò)數(shù)據(jù)分析軟件DPS7.05進(jìn)行0-1數(shù)據(jù)聚類分析。

圖2 感病S型

表4 0.70相似系數(shù)下29個(gè)供試菌株的遺傳譜系

Table 4 Genetic lineage for 29 strains ofM.oryzaeunder 0.70 similarity coefficients

譜系Pedigree菌株號(hào)Isolate菌株數(shù)Sum比例( %)PercentageI1,7,8,16,29,2,5,9,23,3,15,201241.3II10,18,17310.4III19,2526.9IV2413.5V4,12,6,14,21,11,13724.1VI22,2726.9VII26,2826.9

由表4可知，在相似系數(shù)0.39，差異系數(shù)0.61水平下，29個(gè)稻瘟病菌單孢菌株被劃分在同一個(gè)宗譜內(nèi)；相似系數(shù)0.70，差異系數(shù)0.30水平下，29個(gè)供試菌株可劃分為7個(gè)宗譜，根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果得知，I宗譜為優(yōu)勢(shì)宗譜，有12個(gè)菌株，占總菌數(shù)的41.3 %，V宗譜中有7個(gè)菌株，占總菌數(shù)的24.1 %，其他5個(gè)宗譜均含有1～3個(gè)菌株占總菌數(shù)的34.6 %。從聚類分析看，湖南桃江最新一批分離出來(lái)的稻瘟病菌仍然具有顯著差異性，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，極個(gè)別菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

2.3 無(wú)毒基因鑒定結(jié)果

通過(guò)19個(gè)菌株對(duì)19個(gè)NILs水稻品系致病能力測(cè)定，19個(gè)稻瘟病菌株對(duì)含單抗基因NILs水稻品種的致病率在35 %～75 %，強(qiáng)致病力菌株(PF 70 %)有3株，分別為4、8、12號(hào)菌株，占總菌數(shù)的15.7 %，；較強(qiáng)致病力菌株(70 %>PF≥50 %)7株，分別為3、6、7、9、10、14、16號(hào)菌株，占總菌數(shù)36.8 %；中等致病力菌株(50 %>PF≥20 %)9株，占總菌數(shù)的47.5 %；本實(shí)驗(yàn)的供試菌株都表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力，沒有檢測(cè)出致病力弱的菌株。

供試菌株對(duì)18個(gè)含單抗基因的水稻品系(NILs)表現(xiàn)出不同的毒力水平，平均毒力頻率為49.86 %，其中對(duì)Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta3個(gè)單抗瘟基因毒力頻率超過(guò)70 %，屬于強(qiáng)毒力。也表明這些抗性基因在桃江稻區(qū)沒有利用價(jià)值；供試菌株對(duì)Pi-kp、Pi-z5、Pi-t、Pi-sh、Pi-55個(gè)抗性基因型的毒力頻率介于50 %～70 %，具有較強(qiáng)的毒力，預(yù)示這些抗性基因若在該地區(qū)利用將導(dǎo)致稻瘟病流行風(fēng)險(xiǎn)很大；其余抗性基因型的毒力頻率均低于50 %；抗性基因Pi-3、Pi-i、Pi-11、Pi-19、Pi-12抗性優(yōu)良(表5)。

M: 2000 bp DNA marker; CK: 陰性對(duì)照(ddH2O); 1～20: 菌株編號(hào)

圖4 19個(gè)稻瘟病菌株致病能力

3 討 論

本研究對(duì)分離自桃江地區(qū)的稻瘟病菌經(jīng)SSR進(jìn)行分析，其在分子多態(tài)性方面的差異在相似系數(shù)0.70水平上，29個(gè)供試菌株可分為7個(gè)宗譜，優(yōu)勢(shì)宗譜占總菌數(shù)的41.3 %。不同水稻品種分離出來(lái)的菌株遺傳差異較大，這與周益軍[10]的研究結(jié)果相一致，即水稻品種的差異會(huì)對(duì)稻瘟病菌株遺傳多樣性造成比較大的影響。但是分析發(fā)現(xiàn)，源于相同栽培品種中的不同菌株之間雖存在差異但是差異較小，如12、13、14號(hào)菌株都是在湘晚秈-32上分離獲得的稻瘟病菌株，通過(guò)聚類分析這3個(gè)菌株都屬于同一個(gè)宗譜。而相同品系農(nóng)香-32分離的15、16、17號(hào)菌株以及由中早-39分離出的18、19號(hào)菌株，均與各自品系分離出的菌株不屬于同一個(gè)宗譜；這與周瑚等[5]、Ngueko等[11]以及郭麗穎等[4]的研究結(jié)果相似，這可能是因水稻品種、氣候條件、研究菌株數(shù)不夠等各方面因素存在差異而造成。

本研究結(jié)果表明，2017年湖南省桃江稻瘟病圃多數(shù)稻瘟病菌對(duì)攜帶已知抗病基因的水稻單抗病基因品系具有較強(qiáng)的致病力。從毒力頻率結(jié)果看，稻瘟病菌株對(duì)含單抗基因Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta毒力頻率高達(dá)70 %以上，童建新[12]2012年研究結(jié)果表明，無(wú)毒基因Avr-Pi-ks、Avr-Pi-ta在湖南地區(qū)已經(jīng)沒有了抗性優(yōu)勢(shì)；虞選杰[13]、劉翔等[14]的2013-2014年的結(jié)果中抗性基因Pi-ks、Pi-zt毒力頻率達(dá)到80 %以上；周瑚等[5]研究表明，2015年抗瘟基因Pi-zt毒力頻率達(dá)到85 %。綜合表明Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta3個(gè)抗性基因基本喪失對(duì)桃江病圃稻瘟病菌的抗性。湖南桃江稻區(qū)不能再將抗瘟基因Pi-ks、Pi-zt、Pi-ta作為抗源基因使用?？剐曰騊i-kp、Pi-z5、Pi-t、Pi-sh、Pi-5毒力頻率介于50 %～70 %之間，毒力較強(qiáng)，與周瑚等[5]2016年的結(jié)論大致相同。說(shuō)明近幾年這些抗性基因的抗性可能會(huì)進(jìn)一步喪失，在選育抗病水稻品種時(shí)與之相對(duì)應(yīng)的抗性品種在湖南地區(qū)需要慎重使用；其余無(wú)毒基因的毒力頻率低于50 %，水稻品種對(duì)其表現(xiàn)較好的抗性，Pi-i、Pi-3、Pi-11、Pi-12、Pi-19抗性優(yōu)良，與童建新[12]的2012年研究結(jié)果Pi-zt、Pi-1、Pi-3、Pi-7表現(xiàn)出良好的抗性結(jié)果相差較大。Pi-zt、Pi-1、Pi-73個(gè)抗瘟基因在桃江稻區(qū)抗性已經(jīng)逐年喪失；只有Pi-3仍可作為有效的抗瘟基因。此外，趙正洪等[15]研究表明，Pi-1和Pi-k2個(gè)抗瘟基因抗性優(yōu)良，可直接作為湖南省稻瘟病的抗源基因，Pi-ta、Pi-3、Pi-12雖仍具有較強(qiáng)抗性，但是抗病能力正逐步喪失。本研究結(jié)果表明，湖南桃江稻區(qū)Pi-1和Pi-k2個(gè)抗瘟基因正逐步感病化，Pi-ta的抗性已經(jīng)喪失，Pi-3、Pi-12可作為抗性基因。謝倩鳳等[16]2015年的研究顯示，廣州地區(qū)攜帶Pi-ta基因位點(diǎn)的供試材料比例為54.9 %和76.8 %，其出現(xiàn)頻率相對(duì)較高，但在以YL155/YL87 標(biāo)記檢測(cè)到Pi-ta基因的材料中，少數(shù)材料以ta5 標(biāo)記檢測(cè)不到Pi-ta基因。這說(shuō)明廣州地區(qū)Pi-ta雖保持較好抗性，但是有潛在感病化風(fēng)險(xiǎn)。綜上，體現(xiàn)稻瘟病菌遺傳結(jié)構(gòu)復(fù)雜，水稻抗瘟基因的抗性隨著時(shí)間的推移波動(dòng)，且幅度較大，這可能是由于單一水稻品種栽培多年而導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)生新的毒力小種使水稻抗性逐漸喪失。

表5 19個(gè)單孢菌株對(duì)個(gè)NILs的毒力頻率

4 結(jié) 論

湖南桃江病圃稻瘟病菌群體具有豐富的遺傳多樣性，而且存在復(fù)雜的致病性分化，在稻瘟病菌和水稻品種共同進(jìn)化過(guò)程中，稻瘟病菌的無(wú)毒基因組成會(huì)隨著水稻抗瘟基因的變化而產(chǎn)生新的毒力小種，從而導(dǎo)致水稻抗瘟性喪失。因此，只有不斷淘汰已失去抗性的抗瘟基因水稻品種，引進(jìn)含新的抗瘟基因水稻品種，并使多個(gè)抗病基因聯(lián)合抗病，才能長(zhǎng)期有效的控制水稻稻瘟病的發(fā)生。