高錳誘導(dǎo)甘蔗幼苗黃化的基因型差異研究

常敏敏，梁莉燕，楊 曙，崔馨月，趙尊康，黎曉峰

(蔗糖產(chǎn)業(yè)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心/廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是食糖生產(chǎn)的主要原料，其在我國(guó)主要種植區(qū)位于廣西、云南、廣東和福建等南方省(自治區(qū))[1]，這些區(qū)域?qū)偎嵝酝寥赖貐^(qū)，酸性土壤中錳過(guò)多是限制作物生長(zhǎng)的主要因素。多年來(lái)，我國(guó)甘蔗主產(chǎn)蔗區(qū)連年發(fā)生嚴(yán)重的甘蔗幼苗錳毒黃化問(wèn)題，蔗農(nóng)經(jīng)濟(jì)損失慘重[1-4]，解決甘蔗幼苗黃化問(wèn)題迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】甘蔗幼苗黃化發(fā)生在強(qiáng)酸性土壤中[1-2]，積累過(guò)多錳的幼苗出現(xiàn)黃化[2-4]。幼苗黃化受鐵素營(yíng)養(yǎng)的影響，外源鐵可有效減緩甘蔗幼苗黃化[5-7]。不同基因型植物對(duì)錳毒抗性不同。如，Kneja 434和Kneja 605分別屬于玉米耐錳和敏感基因型[8]。豇豆對(duì)錳毒的耐性也存在明顯的基因型差異[9]。植物對(duì)過(guò)多錳影響的外部排斥或內(nèi)部忍耐機(jī)制參與錳毒及抗性的調(diào)控[10]。阻礙過(guò)多錳吸收是柱花草抵御錳毒的排斥機(jī)制[11]。錳與細(xì)胞壁的結(jié)合則與豇豆耐錳密切相關(guān)[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】選育耐錳新品種是解決甘蔗幼苗黃化問(wèn)題的有效途徑，而揭示甘蔗對(duì)錳毒黃化抗性的基因型差異是選育耐錳甘蔗新品種的基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析過(guò)多錳對(duì)甘蔗幼苗黃化及葉片葉綠素含量影響的基因型差異及其與植株錳吸收、含量、分布的相關(guān)性，可為甘蔗幼苗黃化問(wèn)題的解決提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

贛56-261、F175、粵糖70-129、粵農(nóng)75-159和新臺(tái)糖22等59個(gè)甘蔗基因型及斑233、斑231兩個(gè)斑茅基因型。

1.2 田間試驗(yàn)

為比較酸性土壤上過(guò)多的錳誘導(dǎo)甘蔗幼苗黃化的基因型差異，于2014年3月在廣西扶綏縣渠黎鎮(zhèn)某蔗地種植上述供試材料。歷年來(lái)該蔗地的新臺(tái)糖22宿根蔗幼苗均發(fā)生嚴(yán)重黃化。供試土壤為第四紀(jì)紅土母質(zhì)發(fā)育的赤紅土，pH 5.14，活性錳41.67 mg/kg。甘蔗按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)方法種植、施肥及管理。在甘蔗三葉期(5月7日)隨機(jī)采集+1葉葉片(15葉/基因型)樣品，3次重復(fù)，按下述方法測(cè)定葉綠素及錳含量。

甘蔗成熟期(2015年2月)砍收蔗莖。第一年宿根蔗幼苗萌發(fā)后，不施肥。4月25日觀察宿根蔗幼苗生長(zhǎng)情況，相機(jī)拍照記錄幼苗長(zhǎng)勢(shì)。同時(shí)，觀測(cè)單位面積幼苗數(shù)及黃化幼苗數(shù)，黃化率(%)=黃化苗數(shù)/總苗數(shù)×100。采用SPAD儀測(cè)定+1葉葉綠素含量。

1.3 培養(yǎng)試驗(yàn)

按照Yang等的方法[12]培養(yǎng)田間試驗(yàn)中宿根蔗幼苗黃化程度明顯不同的典型基因型贛56-261、F175、粵糖70-129、粵農(nóng)75-159、新臺(tái)糖22、斑233及斑231幼苗15 d，驗(yàn)證甘蔗錳毒黃化的基因型差異并分析其成因。

將新臺(tái)糖22的幼苗培養(yǎng)在0(對(duì)照)、0.5 mM MnCl2溶液中，基礎(chǔ)培養(yǎng)液為1/5 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(pH 5.5，下同)。各處理均重復(fù)3次(下同)。培養(yǎng)15 d后收獲植株，稱重。采集+1葉和植株樣品，植株錳吸收量=錳含量×重量。

上述7個(gè)基因型的幼苗培養(yǎng)在0.5 mM MnCl2溶液中。15 d后用SPAD儀測(cè)定+1葉葉綠素含量。收獲植株，拍照、記錄幼苗黃化情況，稱重。樣品經(jīng)洗滌、烘干、粉碎后，分別測(cè)植株、地上部、根系錳含量，計(jì)算植株錳的吸收量及轉(zhuǎn)移系數(shù)(地上部/根系錳含量)。采集甘蔗+1葉樣品，分析鐵錳含量，計(jì)算錳的轉(zhuǎn)移系數(shù)(葉片/葉鞘錳含量)。同時(shí)，分離+1葉片樣品的細(xì)胞壁，測(cè)定錳含量。

另取上述7個(gè)基因型的甘蔗幼苗，以0.5 mM MnCl2溶液預(yù)處理15 d后從莖基部切除植株地上部。根系培養(yǎng)在0.5 mM的CaCl2溶液中。莖基部再次萌發(fā)的甘蔗幼苗繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，相機(jī)拍照記錄其幼苗黃化情況。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

錳、鐵含量測(cè)定及細(xì)胞壁的分離參照Yang et al[12]的方法進(jìn)行。葉綠素含量用便捷式葉綠素含量測(cè)定儀(SPAD 502-PLUS)或丙酮浸提-分光光度法[7]測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳毒脅迫下甘蔗幼苗黃化的基因型差異

種植在酸性錳毒土壤上的新植蔗及斑茅幼苗生長(zhǎng)正常，未發(fā)現(xiàn)葉片明顯黃化現(xiàn)象。葉片葉綠素含量均高于1.0 mg/g FW，而錳含量除個(gè)別基因型外均低于230 mg/kg DW，平均含量?jī)H為149.4 mg/kg DW(圖1)。這些結(jié)果說(shuō)明，種植在酸性土壤中的新植蔗幼苗錳含量不高、未發(fā)生明顯黃化。

新植甘蔗收獲后，挑選宿根蔗幼苗黃化程度明顯不同的典型基因型進(jìn)行研究，一部分基因型的宿根蔗幼苗發(fā)生明顯黃化(圖2)。新臺(tái)糖22宿根蔗幼苗黃化最嚴(yán)重，3葉期葉片已明顯白化，黃化率達(dá)到100 %(表1)?；涋r(nóng)75-159宿根蔗幼苗黃化程度也較重(圖2)，3葉期葉片黃化率達(dá)50.0 %(表1)。贛56-261、F175的黃化癥狀較輕(圖2)，葉片SPAD值較高而黃化率較低(表1)。甘蔗近緣種斑茅中，斑231葉片SPAD值顯著高于斑233，黃化率差異不大(表1)。這些結(jié)果初步說(shuō)明，贛56-261、F175和斑231屬錳毒黃化抗性基因型。

圖1 不同基因型新植蔗+1葉葉片葉綠素(a)和錳含量(b)

0.5 mM Mn培養(yǎng)15 d后，不同基因型甘蔗的葉片葉綠素含量差異顯著(表2)。新臺(tái)糖 22、粵農(nóng)75-159、粵糖70-129及斑233的葉綠素含量顯著降低，僅相當(dāng)于對(duì)照處理的66.9 %～79.8 %。贛56-261、F175及斑231的葉綠素含量降低不顯著，是對(duì)照處理的90 %以上。錳處理后，新臺(tái)糖22的生物量顯著降低，僅相當(dāng)于對(duì)照處理的67.9 %，而其他基因型減少不顯著(表2)。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，贛56-261、F175和斑231為錳毒黃化抗性基因型，新臺(tái)糖22、斑233為錳敏感基因型。

從培養(yǎng)在高錳溶液中的新植蔗莖基部再次萌發(fā)的甘蔗幼苗，經(jīng)不加錳的溶液培養(yǎng)后的幼苗，不同基因型的黃化程度明顯不同(圖3)。新臺(tái)糖22、斑233的葉色明顯偏黃，而贛56-261、F175和斑231的葉色未發(fā)生明顯改變，粵農(nóng)75-159、粵糖70-129介于二者之間。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，贛56-261、F175和斑231為錳毒黃化抗性基因型，新臺(tái)糖22、斑233為錳敏感基因型，而粵農(nóng)75-159、粵糖70-129為中等抗性基因型。

圖2 不同基因型宿根蔗幼苗

表1 宿根蔗幼苗的黃化率

Table 1 Chlorosis rate of sugarcane seedlings

基因型GenotypeSPAD黃化率(%)Chlorosis rate新臺(tái)糖220.0 f100.0粵農(nóng)75-15923.6±0.9 d50.0粵糖70-12927.9±1.2 c33.3贛56-26139.0±0.1 a33.3F17533.1±0.8 b35.7斑23318.5±0.9 e38.5斑23125.8±1.9 cd42.9

注: 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different letters in the same column indicate significant difference at the 0.05. The same as below.

2.2 錳吸收和分布的基因型差異

0.5 mM錳處理15 d后，葉片錳含量和植株的錳吸收量均極顯著增加(圖4)。錳脅迫下，不同基因型甘蔗的錳吸收量不同(圖5)?？剐?F175)和中等抗性基因型(粵糖70-129、粵農(nóng)75-159)的錳吸收量顯著高于新臺(tái)糖22，但另一抗性基因型贛56-261對(duì)錳吸收量與新臺(tái)糖22的量相當(dāng)。但斑233與斑231的錳吸收量差異不顯著。可見(jiàn)，錳吸收是影響甘蔗錳毒黃化基因型差異的因素之一。

錳從根系向地上部的轉(zhuǎn)移系數(shù)也存在明顯的基因型差異(圖6-a)。新臺(tái)糖 22的錳轉(zhuǎn)移系數(shù)顯著高于其它基因型。與此相似，錳在葉片與葉鞘間錳轉(zhuǎn)移系數(shù)新臺(tái)糖 22也顯著高于其它基因型(圖6-b)。

圖3 不同基因型宿根蔗幼苗

表2 甘蔗幼葉的葉綠素含量和生物量

錳脅迫下不同基因型甘蔗葉片的錳含量差異顯著(圖7)。新臺(tái)糖22的幼葉片錳含量顯著高于其它基因型。錳抗性基因型F175，葉片錳含量雖然與粵糖70-129相當(dāng)，但顯著低于敏感(新臺(tái)糖22)的基因型。另一抗性基因型贛56-261，葉片錳含量顯著低于粵糖70-129和新臺(tái)糖22?？梢?jiàn)，葉片錳含量也是決定甘蔗幼苗黃化的重要因素。

錳脅迫下，不同基因型甘蔗的幼葉片細(xì)胞壁錳含量差異不顯著(圖8)?？剐曰蛐虵175、贛56-261的細(xì)胞壁錳含量與其它基因型的含量相當(dāng)。斑233及斑231細(xì)胞壁錳含量差異也不顯著。

柱狀圖上**表示差異極顯著Different letters on the same parameter indicates significant difference between the treatments at P<0.01 (**)

2.3 植株鐵素營(yíng)養(yǎng)的基因型差異

鐵是影響植物錳毒黃化的重要因素，增加鐵的供應(yīng)是緩解錳毒的主要措施[6-7]。0.5 mM錳處理15 d 后，贛56-261 、F175葉片鐵含量顯著高于其它基因型，說(shuō)明甘蔗對(duì)錳毒黃化的抗性與植株較高的鐵水平有關(guān)。然而，兩個(gè)斑茅基因型的葉片鐵含量差異不顯著，說(shuō)明斑茅對(duì)錳毒黃化抗性的差異不是植株鐵素水平不同所致。

植物正常生長(zhǎng)發(fā)育需要維持體內(nèi)正常的鐵錳平衡。錳處理甘蔗15 d后，不同基因型甘蔗葉片的鐵錳比差異顯著(表3)。贛56-261的葉片鐵錳比顯著高于其他基因型的甘蔗。2個(gè)斑茅基因型間的鐵錳比無(wú)差異。

3 討 論

酸性土壤中甘蔗幼苗黃化是錳過(guò)量的毒害問(wèn)題[3-4]。篩選和培育耐錳品種是解決錳毒問(wèn)題的有效途徑。本研究結(jié)果表明，甘蔗對(duì)錳毒黃化抗性存在明顯的基因型差異。新臺(tái)糖22屬錳敏感基因型，種植在酸性土壤的宿根蔗幼苗及錳過(guò)量溶液中的甘蔗莖基部再次萌發(fā)的幼苗均發(fā)生明顯黃化，葉綠素含量、葉片黃化率顯著低于其它基因型，且錳脅迫下生物產(chǎn)量顯著降低；相反，F(xiàn)175和贛56-261為錳黃化抗性基因型，種植在酸性土壤的宿根蔗幼苗及錳過(guò)量的水培溶液中的莖基部再次萌發(fā)的幼苗均觀察不到幼苗明顯黃化，且錳脅迫下葉片葉綠素含量較高；粵農(nóng)75-159、粵糖70-129為中等抗錳基因型；斑231的抗性也強(qiáng)于斑233。

圖例中柱狀圖上的不同字母表示在P<0.05差異顯著，下同Columns with different letters indicate significant difference at P<0.05. The same as below

圖6 錳從根系向地上部的轉(zhuǎn)移系數(shù)(a)及幼葉中葉片與葉鞘間的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(b)的基因型差異

闡明植物抗錳機(jī)制是培育抗性新品種的前提。阻止錳過(guò)量吸收是一些植物基因型抵御錳毒的外排機(jī)制[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，敏感基因型新臺(tái)糖22，對(duì)錳的吸收最低?？剐曰蛐挖M56-261的錳吸收量雖然與新臺(tái)糖22相當(dāng)，但顯著低于抗性中等的基因型?？梢?jiàn)，抵御錳的過(guò)量吸收是甘蔗抵御錳引起的幼苗黃化的機(jī)制之一。

地上部是錳毒害的主要部位[15]。錳引起的甘蔗幼苗黃化首先發(fā)生在幼葉上[6-7]。幼葉的錳含量與葉片的黃化關(guān)系密切[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，錳脅迫下幼葉Mn含量極顯著增加。敏感基因型(新臺(tái)糖22)的錳含量顯著高于抗性基因型。雖然新臺(tái)糖22對(duì)錳的吸收量顯著低于其它基因型，但錳向地上部的轉(zhuǎn)移系數(shù)和葉鞘向葉片的轉(zhuǎn)移系數(shù)均顯著高于其它基因型。這些結(jié)果說(shuō)明，減少錳向地上部，特別是減少錳向幼葉片的運(yùn)輸，可能是甘蔗幼苗黃化抗性基因型差異的原因之一。

圖7 葉片錳含量的基因型差異

表3 葉片的鐵含量及鐵錳比

Table 3 Iron content and iron-manganese ratio in the leaf of sugarcane seeding

基因型Genotypes鐵含量(mg/kg DW)Fe contentFe/Mn新臺(tái)糖 2247.33±0.48 b0.019±0.000 bc粵農(nóng)75-15947.64±3.80 b0.020±0.002 bc粵糖70-12951.23±3.89 b0.016±0.001 c贛56-26171.54±1.10 a0.026±0.001 aF17567.93±0.67 a0.020±0.001 bc斑23352.08±1.00 b0.019±0.001 bc斑23157.58±5.98 b0.023±0.003 ab

圖8 葉片細(xì)胞壁錳含量的基因型差異

植物生長(zhǎng)發(fā)育需要維持正常的鐵錳平衡，植物鐵素營(yíng)養(yǎng)及鐵錳比影響錳毒害發(fā)生[7]。甘蔗葉片的活性鐵含量隨錳濃度的增加而顯著降低，鐵錳含量比值在錳脅迫下也呈下降趨勢(shì)[6]。抗性基因型(F175、贛56-261)鐵含量顯著高于敏感和中等敏感的基因型。

斑茅是甘蔗的近緣種，但在錳脅迫下植株對(duì)錳吸收量、葉片及其細(xì)胞壁中錳的含量及葉片鐵含量均差異不顯著，相關(guān)機(jī)制有待闡明。

4 結(jié) 論

甘蔗對(duì)過(guò)多錳引起的幼苗黃化抗性存在明顯的基因型差異，F(xiàn)175和贛56-261是抗錳基因型，新臺(tái)糖22是錳敏感基因型，粵農(nóng)75-159、粵糖70-129是中等抗錳基因型。這些差異與錳含量、吸收、分布及植株的鐵素營(yíng)養(yǎng)水平密切相關(guān)。