二甲雙胍作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)階段對(duì)v-SNAREs蛋白家族mRNA表達(dá)的影響

任 毅，楊 霞2，侯敬天，呂 欣3，王建紅4，劉云峰，楊 靜

糖尿病是當(dāng)今人類致死致殘的主要原因之一，給社會(huì)發(fā)展和家庭帶來了沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，對(duì)于糖尿病采取降糖等有效管理，可以預(yù)防心血管疾病和糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生[1]。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)，2015年全球的糖尿病患病人數(shù)已達(dá)4.15億人，如不采取有效措施，預(yù)估到2040年糖尿病患病人數(shù)將達(dá)6.42億人[2]，因而防治糖尿病是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)領(lǐng)域急迫解決的重要任務(wù)。2型糖尿病占糖尿病總?cè)巳?0%以上，胰島素抵抗是其主要的病理特征[3]。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子4(GLUT4)胞吐與胞吞之間的動(dòng)態(tài)平衡是葡萄糖保持正人億，糖尿病相關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用將突破 8 020 億美常攝取及血糖維持穩(wěn)定的重要因素。GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)障礙以及GLUT4的表達(dá)或活性下降是導(dǎo)致機(jī)體胰島素抵抗的重要分子機(jī)制[4]。囊泡相關(guān)可溶性N-乙?；鶃啺访舾幸蜃痈街鞍资荏w(vescical-souble N-ethymaleimide sensitive factor attachment proteins receptor， v-SNAREs)在GLUT4囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中起著非常關(guān)鍵的作用。

二甲雙胍(Met)是2型糖尿病治療的基石藥物，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。研究證實(shí)，Met可以促進(jìn)GLUT4的表達(dá)，也可以調(diào)控GLUT4的轉(zhuǎn)位和內(nèi)吞[5-10]。主流觀點(diǎn)認(rèn)為Met是AMPK的天然激活劑，研究表明，Met主要經(jīng)由AMPK信號(hào)途徑對(duì)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而改善胰島素抵抗[9-11]。深入的研究表明，Met對(duì)脂肪細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控可通過某些v-SNAREs介導(dǎo)完成[12-13]。v-SNAREs的主要蛋白為囊泡相關(guān)膜蛋白(vesicle associated membrane proteins，VAMPs)亞家族，目前共鑒定了7種亞型即VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP4、VAMP5、VAMP7、VAMP8[14]。本課題組前期研究也觀察到在人網(wǎng)膜成熟脂肪細(xì)胞，Met可以通過調(diào)節(jié)VAMPs的表達(dá)而參與調(diào)控GLUT4 轉(zhuǎn)運(yùn)[15]。心肌細(xì)胞經(jīng)Met長(zhǎng)時(shí)間作用下(18 h)可以通過AMPK途徑顯著改善GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)，提示延長(zhǎng)作用時(shí)間可以更有效地發(fā)揮Met的作用[10]。因此推斷將Met長(zhǎng)時(shí)間作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程，也可以改善脂肪細(xì)胞GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)，且v-SNAREs在這一過程中扮演著重要角色。本研究將Met作用于3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化階段，比較脂肪細(xì)胞成脂分化成熟后GLUT4、AMPK、VAMPs的mRNA表達(dá)水平，旨在探索Met在誘導(dǎo)分化階段對(duì)v-SNAREs的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 美國(guó)Gibco公司的DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗；賽業(yè)生物科技有限公司的小鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液和B液、油紅O染料；上海博士德的磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰酶；美國(guó)Sciencell公司的胎牛血清(FBS)；美國(guó)Sigma公司的Met；上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司的PCR試劑盒；美國(guó)Invitrogen公司的Trizol RNA提取液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代 購(gòu)買3T3-L1前脂肪細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院的上海細(xì)胞庫(kù))；將3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%FBS、1%雙抗)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)內(nèi)，間隔2～3 d換培養(yǎng)液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)棄掉原培養(yǎng)基，用PBS沖洗2次，然后加入胰酶(1 mL)，2 min后終止消化，吹打均勻后移至離心管離心3 min(離心1 000 r/min)。離心后棄上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基，吹打均勻，依照2×104個(gè)/cm2的密度于新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種，重復(fù)上述培養(yǎng)步驟。

1.2.2 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂誘導(dǎo) 3T3-L1前脂肪細(xì)胞在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)的融合度達(dá)80%～90%時(shí)，依照上述步驟，6孔板中以2×104個(gè)/cm2的密度接種，繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板的細(xì)胞融合度達(dá)到100%或過融合時(shí)，開始加入小鼠脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)，交替給予A液2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h(3 d)，和B液2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h(1 d)，共交替3個(gè)周期(12 d)。

1.2.3 油紅O鑒定 6孔板中成脂誘導(dǎo)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基，予以PBS沖洗2次，每孔加4%甲醛液(2 mL)固定，30 min。吸棄甲醛液，予以PBS沖洗2次，每孔加油紅O染液(1 mL)染色，30 min。吸棄油紅O染液，予以PBS沖洗2次，將6孔板置于相差顯微鏡下觀察成脂情況。成熟的脂肪細(xì)胞可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染紅的脂滴，呈串珠狀排列，提示誘導(dǎo)成功。

1.2.4 分組與干預(yù)方法 依照加入的Met終濃度分為0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L 4組，每組3個(gè)復(fù)孔。將3T3-L1前脂肪細(xì)胞于6孔板接種培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到100%或過融合時(shí)，分別在誘導(dǎo)分化階段(12 d)持續(xù)加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(A液或B液)1 960 μL和與終濃度相對(duì)應(yīng)的Met液40 μL。

1.2.5 細(xì)胞mRNA的收集 將待測(cè)定細(xì)胞吸棄原培養(yǎng)基，每孔中加入TrizolRNA提取液0.5 mL，使細(xì)胞充分裂解后，移入2 mL的凍存管，置于液氮中凍存(-196 ℃)，以備后續(xù)檢測(cè)。

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)

1.2.6.1 引物設(shè)計(jì) 所有引物均由上海生工設(shè)計(jì)，軟件使用Primer Premier 5.0，β-actin為內(nèi)參基因。詳見表1。

表1 基因引物序列

1.2.6.2 cDNA的合成 11 μL總RNA(1 μg)，1 μL Random Primer p(dN)6(0.2 μg/mL)，65 ℃孵育5 min；4 μL 5×Reaction Buffer，3 μL dNTP(10 mmol)，1 μL RNA酶抑制劑(20 U/μL)和1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶(20 U/μL)，孵育：25 ℃10 min，42 ℃60 min，72 ℃15 min。

1.2.6.3 熒光定量PCR檢測(cè) 10 μLSYBR Green Master (ROX)，0.5 μL Forward引物(15 μmol)， 0.5 μL Reverse 引物(15 μmol)，2 μL cDNA，7 μL DNase/RNase-free的ddH2O，共合計(jì)20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃10 min，活化Tag酶；95 ℃15 s，60 ℃60 s，共循環(huán)40次。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度Met對(duì)成脂分化的影響 在誘導(dǎo)分化過程中持續(xù)給予0 mmol/L、0.5 mmol/L、1、2 mmol/L Met，經(jīng)3周期誘導(dǎo)分化成脂后，經(jīng)油紅O染色后，經(jīng)Met干預(yù)后，0 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L 3組無(wú)明顯變化，2 mmol/L染色明顯變淺。詳見圖1～圖4。

圖1 Met 0 mmol/L組(×250)

圖2 Met 0.5 mmol/L組(×250)

圖3 Met 1 mmol/L組(×250)

圖4 Met 2 mmol/L組(×250)

2.2 不同濃度Met對(duì)AMPK、GLUT4、VAMPs、mRNA表達(dá)的影響 比較不同組間AMPK、VAMP4、VAMP7 mRNA水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4組間GLUT4 mRNA存在差異，進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)，1 mmol/L組較0 mmol/L組升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2 mmol/L組較1 mmol/L組降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。4組間VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步行LSD檢驗(yàn)：①與0 mmol/L組相比，0.5 mmol/L組VAMP2、VAMP 3、VAMP 8 mRNA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；②與0 mmol/L組相比，1 mmol/L組VAMP2、VAMP3、VAMP8 mRNA水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③與1 mmol/L組相比，2 mmol/L組VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；④與0 mmol/L組相比，0.5 mmol/L組、2 mmol/L組VAMP5 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。詳見表2。

3 討 論

多個(gè)國(guó)家的糖尿病診治指南中均推薦Met作為2型糖尿病病人控制血糖的一線用藥和聯(lián)合用藥中的基本用藥[1， 16]。充分的證據(jù)表明Met增強(qiáng)胰島素敏感性的作用是通過激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的，Met實(shí)際上是一種天然的AMPK激活劑[12-13]。既往研究表明，Met可以通過AMPK途徑調(diào)節(jié)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)[11]，但是至今尚未完全闡明GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)各步驟的具體分子調(diào)控機(jī)制。

表2 不同濃度Met對(duì)脂肪細(xì)胞AMPK、GLUT4、VAMPs mRNA表達(dá)的影響(±s)

與0 mmol/L組比較，1)P<0.05； 與1 mmol/L組比較，2)P<0.05

近年來的研究證實(shí)VAMPs為GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)過程中所必不可少的v-SNAREs蛋白家族，但VAMPs家族中各亞型在調(diào)控過程的具體作用頗有爭(zhēng)議，各亞型之間的作用是相對(duì)獨(dú)立還是可以相互替代，各實(shí)驗(yàn)結(jié)論并不一致，可能與在不同模型、不同刺激條件下的探索有關(guān)[17-18]。研究表明，VAMP2是介導(dǎo)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的主要v-SNAREs蛋白，對(duì)胰島素刺激下的GLUT4儲(chǔ)存囊泡胞吐過程尤為重要[19-22]。多數(shù)研究支持VAMP2在GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)過程中是不可或缺的[17， 23]，但也有研究發(fā)現(xiàn)VAMP2可以被VAMP3或VAMP8所取代[18， 23]。在L6肌細(xì)胞中也觀察到VAMP2參與調(diào)節(jié)胰島素刺激下的GLUT4內(nèi)吞過程[22]。VAMP3主要定位于不同階段的內(nèi)體，通常觀點(diǎn)認(rèn)為VAMP3介導(dǎo)了非胰島素刺激下的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)[24-25]，但是在胰島素抵抗模型中發(fā)現(xiàn)，VAMP3也參與了胰島素刺激下的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)，然而此作用必須持續(xù)依賴于VAMP2介入[26]。VAMP3可能調(diào)控GLUT4從早期內(nèi)體向反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)(TGN)的轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。VAMP8作用廣泛，在多種細(xì)胞器上均可發(fā)現(xiàn)，研究表明，VAMP8的作用是介導(dǎo)了GLUT4的內(nèi)吞[20， 28]，基因敲除VAMP8的脂肪細(xì)胞，明顯減弱GLUT4的內(nèi)吞作用[20]，從而使保留在細(xì)胞膜上的GLUT4增多，對(duì)葡萄糖攝取有促進(jìn)作用。

脂肪組織是調(diào)控整體能量代謝的重要器官，脂肪細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控是機(jī)體控制葡萄糖的重要機(jī)制[29]。本實(shí)驗(yàn)在3T3-L1前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程中分別持續(xù)給予不同濃度的Met干預(yù)，研究結(jié)果顯示Met可以作用于前脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化過程，1 mmol/L可能是Met在3T3-L1前脂肪細(xì)胞調(diào)控GLUT4的最大作用濃度，在1 mmol/L濃度范圍內(nèi)，隨著Met濃度增加，可以上調(diào)脂肪細(xì)胞中GLUT4 mRNA的表達(dá)，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴效應(yīng)。同時(shí)，Met呈劑量依賴性的上調(diào)脂肪細(xì)胞中VAMP2、VAMP3、VAMP8 mRNA的表達(dá)，提示Met可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)，v-SNAREs可能參與了Met對(duì)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控。然而當(dāng)Met濃度達(dá)到2 mmol/L時(shí)，反而下調(diào)GLUT4、VAMP2、VAMP3、VAMP5、VAMP8 mRNA的表達(dá)，推測(cè)與成熟脂肪細(xì)胞數(shù)量相對(duì)不足有關(guān)。因?yàn)橛图tO染色的結(jié)果提示高濃度的Met可能抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的成脂分化，這與王慧等[30]的研究相類似。VAMP2、VAMP3、VAMP8在GLUT4存儲(chǔ)囊泡上均有發(fā)現(xiàn)，脂肪細(xì)胞同時(shí)敲除 VAMP2、VAMP3、VAMP8 的3個(gè)亞型基因，可完全抑制胰島素誘導(dǎo)的 GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)[18]，提示VAMP2、VAMP3、VAMP8在調(diào)節(jié)GLUT4囊泡胞吐時(shí)具有至關(guān)重要的地位。當(dāng)然VAMP3、VAMP8 亦介導(dǎo)非胰島素刺激下的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)。觀察到Met在3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)成熟階段可以促進(jìn)VAMP2、VAMP3、VAMP8的表達(dá)，但調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的具體意義有待進(jìn)一步明確。

在本研究中，不同濃度的Met并未影響AMPK的mRNA表達(dá)量，提示Met在誘導(dǎo)分化過程中可能通過促進(jìn)AMPK的磷酸化，或者通過AMPK以外的其他途徑影響v-SNAREs調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)。

在成脂誘導(dǎo)階段持續(xù)予以Met處理，可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞GLUT4 mRNA的表達(dá)，Met對(duì)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控可能與其對(duì)v-SNAREs亞家族成員表達(dá)的調(diào)節(jié)相關(guān)，1 mmol/L可能為最大作用濃度，在1 mmol/L內(nèi)其作用效果呈一定的濃度依賴性。此研究將為Met在調(diào)控GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)中的具體作用機(jī)制提供理論依據(jù)。