結(jié)締組織生長因子對大鼠放射性心臟損傷作用的實驗研究

放射性心臟損傷(radiation induced heart disease，RIHD)即胸部腫瘤放療引起的常見遲發(fā)性不良反應(yīng)之一，可明顯增加長期生存病人的死亡風(fēng)險[1]。放射性心肌纖維化是RIHD的重要病理過程[2]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor， CTGF)可誘導(dǎo)組織發(fā)生纖維化[3-4]，然而目前研究對CTGF與放射性心肌纖維化的確切機(jī)制并不清楚?；诖耍緦嶒炗^察大鼠受照射后心臟CTGF mRNA、蛋白水平隨時間的變化，并分析其與RIHD發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為進(jìn)一步治療RIHD的實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠18只(12～14 周)，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，體重200～230 g，均給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料和潔凈自來水任其自由攝取。所有實驗大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，對照組(6只)：心臟不接受照射(0 Gy)；心臟照射后3個月(3M)組(6只)：心臟接受照射(20 Gy)后飼養(yǎng)3個月；心臟照射后6個月(6M)組(6只)：心臟接受照射(20 Gy)后飼養(yǎng)6個月。

1.2 RIHD模型制備 心臟照射組SD大鼠以3%戊巴比妥鈉(20 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，取仰臥位將四肢固定自制的木板上，照射野大小設(shè)3 cm×3 cm，上界在胸骨角下緣，下界為上界向劍突方向下移3 cm，左界以中線向左旁開2cm，右界為中線向右旁開1 cm。制作鉛塊防護(hù)肺及腹部器官，位置驗證后，以直線加速照射，6Mv X線，單次照射劑量20 Gy，劑量率300 Gy/min，照射距離1 m，劑量計算點濃度2.5 cm。1.3 Masson′s三色染色 取心肌組織用10%甲醛固定，石蠟包埋后制備5 μm切片，脫蠟至水化，Masson染色后，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固。通過全自動圖像分析系統(tǒng)對膠原進(jìn)行定量分析，計算間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.4 RT-qPCR檢測心肌組織CTGF和纖維粘連蛋白(FN)mRNA 按試劑盒說明用TRIzol?試劑(9108，TaKaRa，Japan)提取心肌組織的總RNA。根據(jù)制造商提供的方案合成cDNA。CTGF和FN的引物由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成，序列：CTGF，上游：5′-CCTGACCCAACT ATGATGC-3， 下游：5′- CCCTTACTCCCTGGCTTT-3； FN，上游：5′- TCG CTTTGACTTCACCAC-3′，下游： 5′- CTTCCTCGCTCAGTTCGT-3； 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)， 上游：5′-GGATTTGGTCGTATTGGG-3′，下游：5′- GGAAGATGGTGATGGGATT-3′。樣本相對于GAPDH的倍數(shù)變化通過比較Ct法即2-ΔΔCt計算得到。

1.5 Western Blotting檢測心肌組織CTGF和FN的蛋白表達(dá) 將心肌組織加入冰冷的裂解液中分離提取總蛋白，根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒說明(Piece， Carlsbad， CA， USA)進(jìn)行檢測。特異性CTGF多克隆抗體(1∶400；sc-365970；Santa Cruz Biotechnology， Inc.)和FN多克隆抗體(1∶500；sc-53286；Santa Cruz Biotechnology， Inc.) 濃度(1∶2 000)，二抗?jié)舛?1∶5 000)用Image J軟件(NIH， MA， USA)分析條帶，目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比即為樣品目的蛋白的相對含量。

2 結(jié) 果

2.1 Masson′s 三色染色 對照組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，幾乎無膠原蛋白染色； 3M組心肌細(xì)胞間及血管周可見膠原含量增多；而6M組心肌細(xì)胞間及血管周膠原成分比3M組增加更加明顯(見圖1)。圖像分析系統(tǒng)定量分析測算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，3M組為(4.45±0.30 )%，對照組為(3.33±0.14 )%，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，6M組(5.88±0.20)%與對照組、3M組相比均有增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.2 大鼠心臟照射后 CTGF mRNA、FN mRNA表達(dá)水平的變化 與對照組相比， 3M組CTGF和FN mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)；6M組與對照組相比增加更明顯(P<0.01)，且比3M組表達(dá)亦增高(P<0.01)。詳見圖3。

與對照組比較， *P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.3 Western blot 檢測蛋白表達(dá)的結(jié)果 與對照組相比， 3M組、6M組CTGF 和FN蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；且6M組比3M組表達(dá)亦增高(P<0.01)。詳見圖4。

與對照組比較， *P<0.01；與3M組比較，#P<0.01

2.4 CTGF與心肌組織纖維化程度的相關(guān)性分析 心臟受照后隨時間延長纖維化程度的CVF 指標(biāo)與CTGF mRNA (r=0.959，P<0.01)、CTGF蛋白(r=0.932，P<0.01)表達(dá)均呈正相關(guān)。

3 討 論

本研究可見，大鼠心臟被輻射3個月后心肌細(xì)胞出現(xiàn)變性，間質(zhì)及小血管管周出現(xiàn)纖維化，6個月后變性加重，心肌壞死，纖維化間質(zhì)及小血管管周纖維化更加明顯。與既往動物實驗一致，心臟被輻射可形成放射性心肌纖維化[2]。輻射引起的心肌纖維化和重塑可能引起心臟功能障礙[5-6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心臟受照射3個月后CTGF mRNA 和蛋白表達(dá)均增高，且受照射6個月后增加更明顯；而細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分FN表達(dá)也有同樣表現(xiàn)，提示CTGF有促纖維化的作用。同時本研究對心肌組織進(jìn)行Masson′s 三色染色，并通過定量分析CVF，發(fā)現(xiàn)心臟纖維化也隨輻射后時間延長進(jìn)行性加重，并且心肌纖維化程度與CTGF表達(dá)水平呈正相關(guān)。以上結(jié)果均提示CTGF在RIHD的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

有研究證明，轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)參與介導(dǎo)多個器官纖維化病變的發(fā)生發(fā)展過程，同時也是與放射性纖維化密切相關(guān)的細(xì)胞因子[7-9]。Liu等[10]的前期研究提示，大鼠心臟在接受20 Gy 照射后，心肌組織TGF-β1mRNA 表達(dá)水平在受照射后第2周可達(dá)到高峰，第4周下降，此后逐漸升高，至第12周達(dá)到第2個高峰，但較第2周略低。提示TGF-β1不僅參與放射性心臟損傷的起始過程，而且在其發(fā)展階段仍然起著一定的作用。在臨床實驗中，已有研究運(yùn)用己酮可可堿和生育酚以減少放射性纖維化的發(fā)生[11]，但由于TGF-β1除了促纖維化效應(yīng)，還有抗增生和抗炎癥的效應(yīng)，長期完全阻斷TGF-β1系統(tǒng)勢必產(chǎn)生嚴(yán)重后果[12]。TGF-β1是CTGF的誘導(dǎo)劑， TGF-β1的生物學(xué)作用部分由CTGF介導(dǎo)的，在組織纖維化中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在放射性腎臟損傷、放射性肺損傷、放射性肝臟損傷的嚙齒類動物模型中CTGF表達(dá)亦明顯增高，說明CTGF參與了放射性纖維化的過程[13-14]。在非人的靈長類動物中，同樣發(fā)現(xiàn)CTGF與多器官的放射性纖維化有關(guān)[15]。然而目前CTGF與放射性心肌纖維化的文獻(xiàn)研究較少。本研究分析CTGF與放射性心肌纖維化的作用，提示CTGF在RIHD的發(fā)生發(fā)展中具有重要參與作用。

心臟被輻射可引起心肌進(jìn)行性纖維化而發(fā)生心室重構(gòu)，導(dǎo)致心功能下降。CTGF在放射性心肌纖維化的進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用，靶向抑制 CTGF可能對RIHD有防治作用。