腦出血大鼠炎性因子TLR4的表達與血腦屏障通透性的關系探討

腦出血是目前常見的腦血管疾病，具有起病急、發(fā)展迅速、致死率高的特點，是嚴重危害中老年人健康的疾病之一。在腦出血的發(fā)病過程中，顱內血腫、腦水腫是病人神經功能障礙的主要原因；而出血后繼發(fā)性局部炎癥反應、血腦屏障通透性的增加，可能是腦組織水腫加重的主要原因。本課題分析炎癥指標及血腦屏障通透性的變化，探討Toll樣受體4(TLR4)在腦出血后繼發(fā)炎癥損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 檸檬酸組織抗原修復液(福州邁新生物技術有限公司)，DAB顯色試劑盒(中杉金橋公司)，羊抗兔多克隆抗體(福州邁新生物技術有限公司)，兔抗-TLR4多克隆抗體(博士德公司)，膠原酶Ⅶ(購自Sigma公司)。動物頭顱立體定位儀(SN-2，NARISHIGE，日本)，微量進樣器(中國醫(yī)藥集團沈陽中沈化玻有限公司)，電子分析天平(BP2llD，塞多利斯，德國)，紫外分光光度儀(UV300，Spechonic Unicam，美國)，組織勻漿機(UP200s，DR Hielscher，德國)，高溫干燥箱(FD53，Binder，德國)，恒溫水浴箱(1070，F(xiàn)EL，德國)。

1.2 動物分組 由山東大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK(魯)2014-0007。SPF級SD雄性大鼠30只(體重250～300 g)，采用隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組，每組15只。

1.3 模型制備 以10%水合氯醛腹腔麻醉。將大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀上，將頭皮丁字型切開，取前囟為中心點，向右3 mm、向后5.5 mm、深度5.5 mm為注射點(尾殼核)，骨鉆鉆一1 mm小孔，進針后緩慢注射膠原酶、肝素、生理鹽水混合液2.0 μL(每1 μL溶液含Ⅳ型膠原酶0.2 U及肝素2 U)，留針5 min后，將針緩慢退出。骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮。假手術組以等量生理鹽水代替膠原酶混合液。

1.4 神經功能缺損評分標準 腦出血模型復制后12 h、1 d、3 d、7 d參照Zea Longa評定[1]進行神經功能評分。0分：無神經功能缺失癥狀，活動正常；1分：不能完全伸展對側前爪；2分：爬行時出現(xiàn)向右轉圈；3分：行走時，身體向偏癱側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失；5分：死亡。選取評分0～4分大鼠。

1.5 TLR4免疫組化、腦組織病理檢測 在各時間點將每組4只大鼠麻醉后斷頭取腦，放入4%多聚甲醛溶液中外固定2周，隨后脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚度的冠狀面石蠟切片，常規(guī)脫蠟水化處理后，分別進行蘇木素-伊紅(HE) 染色和免疫組化染色。TLR4的免疫組化：采用免疫組化二步法，按照試劑盒說明書進行操作，選取每張切片血腫周圍5個不重疊高倍視野，顯微鏡下觀察血腫周圍腦組織TLR4蛋白的陽性細胞數(shù)的表達情況。采用累積光密度(IOD)總和值來反映切片陽性染色細胞數(shù)目。腦組織病理：石蠟切片，HE染色，常規(guī)脫蠟水化后蘇木素染色10 min，自來水沖洗2 min，鹽酸乙醇分化10 s，自來水返藍10 min，伊紅染色5 min，自來水沖洗30 s，蒸餾水沖洗30 s，90%乙醇30 s，95%乙醇2 min×2次，100%乙醇2 min×2次，二甲苯5 min×2次，中性樹膠封片。光鏡下觀察血腫周圍腦組織變化。

1.6 血腦屏障通透性測定 按Belayev法[2]在各時間點將各組4只大鼠麻醉后斷頭取腦前的2 h，從股靜脈注入2%的伊文思蘭(evens blue，EB)溶液(20 mg/kg)；選取大鼠出血側腦組織稱重后，放入試管中，加甲酰胺3 mL，放入54 ℃水浴箱中避光提取24 h，然后在紫外分光光度計下測量提取液的光密度值(OD值)，波長632 nm，腦組織EB含量以OD濕腦組織量(g)表示。

2 結 果

2.1 各組大鼠神經功能缺損評分比較(見表1)

表1 各組大鼠不同時點神經功能缺損評分比較(±s) 分

與假手術組比較，1)P<0.05

2.2 各組大鼠血腦屏障通透性比較(見表2)

表2 各組大鼠不同時點EB含量比較(±s) mg/g

與假手術組比較，1)P<0.05

2.3 各組大鼠TLR4免疫組化比較(見表3)

表3 各組大鼠不同時點腦組織TLR4表達的陽性細胞數(shù)比較(±s) 個

與假手術組同期比較，1)P<0.05；與本組3 d時比較，2)P<0.05

2.4 各組大鼠腦組織病理切片分析 假手術組大鼠腦組織內無出血灶，尾狀核區(qū)細胞結構致密，整齊排列，無水腫及炎細胞浸潤。模型組大鼠腦組織尾狀核區(qū)有出血灶，血腫周圍水腫、大量紅細胞、炎細胞浸潤，神經元壞死。詳見圖1。

3 討 論

近年來，隨著對腦出血損傷機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)腦組織并非完全是免疫豁免區(qū)，腦出血后腦組織同樣會產生炎癥反應[3]。非感染性炎癥、氧自由基的產生及炎癥介質的釋放是腦出血損傷的重要機制，其中TLR4在非感染性炎癥損傷中發(fā)揮著重要作用[4]，炎性因子TLR4是最早發(fā)現(xiàn)的人類Toll樣受體，在免疫應答和炎癥反應中起重要作用，屬于跨膜信號轉導受體和天然免疫系統(tǒng)主要的病原模式識別受體，主要表達于樹突狀細胞和巨噬細胞等免疫細胞表面[5]?，F(xiàn)有資料表明：TLR4與中樞非感染性炎癥的關系最為密切[6-8]。而血腦屏障是存在于腦組織和血液之間的一個復雜的細胞系統(tǒng)，其中血管內皮細胞結構的完整和細胞間的緊密連接是血腦屏障結構與功能得以維持的基礎。研究表明，腦出血發(fā)病早期，有活化的小膠質細胞浸潤，大量中性粒細胞和巨噬細胞聚集在血腫周圍，釋放各種炎性因子，引發(fā)炎癥反應，在腦水腫形成過程中發(fā)揮重要作用[6]；同時炎癥反應也導致血腦屏障通透性增加，大量水溶性物質進入腦組織，可導致腦水腫、顱內壓增高甚至腦疝形成等一系列嚴重結果。

本實驗結果顯示：模型組腦組織病理示尾狀核區(qū)有出血灶，血腫周圍存在水腫、大量紅細胞、炎細胞浸潤，神經元壞死等，說明模型組腦組織受損嚴重，病理形態(tài)發(fā)生改變。神經功能缺損評分隨著時間的延續(xù)，模型組各時間點評分均高于假手術組，并且各時間點TLR4蛋白陽性細胞數(shù)明顯高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，模型組3 d時TLR4蛋白表達量明顯高于其他時間點，差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)，顯示隨著時間的推移，模型組TLR4表達升高，在3 d時達到了最高峰。腦組織內EB含量在出血后12 h即迅速上升，3 d之后緩慢下降，表明腦出血后血腦屏障的完整性受到破壞，通透性增加，其演變過程與TLR4表達過程基本一致。

綜上所述，大鼠腦出血后炎性因子TLR4蛋白表達上調可能加重了血腫周圍腦組織損傷，使血腦屏障通透性增加，加重腦水腫，升高神經功能缺損評分，因此在治療腦出血過程中，加用抑制TLR4表達的藥物，有助于腦出血的治療。