左歸丸、右歸丸對腎虛質(zhì)大鼠海馬MEK表達的影響

腎虛質(zhì)是常見的中醫(yī)體質(zhì)類型之一，是以腎的臟腑功能低下為主要特征的一種體質(zhì)狀態(tài)，又可分為腎陰虛、腎陽虛、腎氣虛、腎精虛等[1]。早在秦漢時期，醫(yī)家就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腎與學習記憶的關(guān)系?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》總結(jié)道“腎藏精舍志，主骨、生髓、通腦?！泵鞔_指出腦與腎密切的相對應(yīng)關(guān)系；《靈樞調(diào)經(jīng)論》曰：“血并于上，氣并于下，亂而善忘”；陳士鐸曰：“補腦必須添精，而添精必須滋腎”《醫(yī)林改錯》曰：“年高腎虧，髓?？仗?，發(fā)為呆病”“小兒無記憶者，腦髓未滿；年高無記憶者，腦髓漸空”，腎虛髓空是學習記憶減退的重要病機[2]，故補腎填精髓是其基本治則。汪昂說：“人之精與志皆藏于腎，腎精不足則志氣不能上通于心，故迷惑善忘也”，提出了記憶與腎精的互化關(guān)系。李偉茜等[3]認為靈機記憶皆出于腦，腦為髓海，精髓是腦生理活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。任晨斌等[4]認為補腎填精髓是治療記憶衰退的基本治則。王建偉等[5]認為治療記憶衰退類疾病應(yīng)益腎化濁，除邪同時重點補腎生髓。歷代醫(yī)家無論從理論探討，還是臨床實踐方面，均認為腎虛的一個重要表現(xiàn)是學習記憶能力的下降，且現(xiàn)代實驗研究發(fā)現(xiàn)，海馬體(海馬回)具有對大腦學習記憶所要求的信息獲取有關(guān)的重要腦區(qū)功能，對記憶的形成及定向功能有明確作用[6]。馬書娟等[7]、康湘萍等[8]認為補血方藥可以通過降低海馬神經(jīng)細胞凋亡，進而改善海馬功能，提高學習記憶能力。探討補腎藥物對海馬區(qū)MEK表達的影響，對于認識與預防因腎虛而至記憶衰退及老年癡呆具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義[9]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康12周齡SD大鼠合籠隨即交配子代鼠，雌雄按1∶1比例共40只，體重260～280 g，西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2012-003。標準飼料喂養(yǎng)，不限其飲食飲水，在室溫22～26 ℃，相對濕度50%～70%環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.2 動物造模 將購回的大鼠雌、雄分別飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按雌、雄1∶1的比例隨機分組并合籠。其中，空白組4只，模型組12只。兩組大鼠雌、雄合籠5 d，各雌鼠成功受孕后，將兩組大鼠雌、雄分別飼養(yǎng)。自此對模型組孕鼠進行恐嚇直至其產(chǎn)子。具體方法為：每日08：30～20：30，將模型組孕鼠放置在土貓活動范圍之內(nèi)，土貓可在鼠籠上自由活動，孕鼠可視及土貓形態(tài)，聞及土貓叫聲，嗅及土貓氣味，以此對孕鼠進行恐嚇?？瞻捉M孕鼠不做任何處理，自由飲食飲水，至其自然生產(chǎn)。不對其恐嚇時，將兩組孕鼠置于同處，以確保非處理因素的一致性。

1.3 子代鼠分組 從空白對照組母鼠所產(chǎn)仔鼠中隨機選出10只，作為空白對照組，不做任何處理，自由飲食飲水。模型組孕鼠產(chǎn)子后，仔鼠隨母鼠飼養(yǎng)28 d，其間停止對其恐嚇，以防仔鼠夭折。28 d后，將模型組母鼠所產(chǎn)仔鼠放置一處，隨機選出30只分為3組，每組10只，分別為左歸丸組、右歸丸組、腎虛質(zhì)模型組。依照前法，每日08：30～20：30對左歸丸組、右歸丸組、腎虛質(zhì)模型組進行恐嚇，連續(xù)1個月。其余時間將4組子代鼠置于同處，以確保其他非處理因素一致。

1.4 實驗藥物

1.4.1 藥物組成 左歸丸組方：熟地、山萸肉、炒山藥、枸杞子、菟絲子、川牛膝、鹿角膠、龜板膠。右歸丸組方：熟地、炒山藥、枸杞子、肉桂、山萸肉、鹿角膠、當歸、菟絲子、炒杜仲、制附子。生理鹽水自行配制。

1.4.2 藥物制備 兩方均按原方藥量配制，中藥飲片均購自陜西中醫(yī)藥大學校醫(yī)院中藥房，將藥材浸泡于6倍藥材量的冷水中15 min，先用武火煎至水沸，后改用文火煎煮40 min，濾出藥液后加入適量冷水，仍由武火煎至水沸，后改用文火煎30 min，濾出藥液，兩煎合并，右歸丸濃縮藥汁至150 mL，左歸丸濃縮藥汁至130 mL，待藥液冷卻后，裝瓶封存，-20℃凍存?zhèn)溆谩Ｉ睇}水：用精密天平稱取0.9 g氯化鈉加入50 mL蒸餾水中混勻，定容至100 mL，制備成0.9%氯化鈉溶液，貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 給藥劑量 在對子代鼠進行恐嚇的同時，空白對照組和腎虛質(zhì)模型組均給予生理鹽水灌胃。中藥組分別給予左歸丸、右歸丸濃縮液灌胃。根據(jù)人與大鼠劑量轉(zhuǎn)換公式計算大鼠的等效計量是人的6.3倍。即子代鼠灌胃右歸丸1.575 g/100 (g·d)，左歸丸1.323 g/100(g·d)。

1.5 實驗試劑 MEK(Elisa)試劑盒由艾來薩生物科技有限公司生產(chǎn)；總蛋白提取試劑盒由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)；BCA蛋白定量試劑盒由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)。

1.6 儀器及耗材 移液器由德國艾本德公司生產(chǎn)；離心管由方科醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)；錫箔紙由雷東日用品廠生產(chǎn)；液氮由西安赫德生物有限公司生產(chǎn)；制冰機(型號CL-300W)由上海芩隆奧利斯公司生產(chǎn)；高速組織勻漿機由艾卡儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；低溫離心機由恒諾儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；生化恒溫孵育箱由恩培儀器制造有限公司生產(chǎn)；全自動酶標儀(型號DNM-9606)由普朗公司產(chǎn)生。

1.7 溶液配制 7%水合氯醛溶液：用精密天平稱取7 g水合氯醛加入50 mL蒸餾水中混勻，定容至100 mL。0.9%氯化鈉溶液：用精密天平稱取9 g氯化鈉加入500 mL蒸餾水中混勻，定容至1 000 mL。

1.8 實驗動物組織取材 取材前對實驗動物禁食12 h，以確保麻醉藥量的準確性，避免取材過程中動物排泄物污染組織及操作臺。各組中隨機取出雌雄各10只，逐個稱重、標記，根據(jù)其體重，按照每0.5 mL/100 g體重的藥量，腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后，快速斷頭取腦，將腦組織包入標記好的錫箔紙中，迅速投入液氮盒內(nèi)。取材完畢后，用長鑷子將所有組織從液氮盒內(nèi)取出，貯存于-80 ℃冰箱中備用，取組織時應(yīng)做好防護措施，避免凍傷。

1.9 操作步驟

1.9.1 提蛋白 將腦組織從-80 ℃冰箱中取出，用精密天平稱取100 mg，用組織剪將稱取的組織剪成細小的碎片，放入4 mL 離心管中，以每20 mg組織加入200 μL 裂解液的比例，在4 mL離心管中加入裂解液，用手持式勻漿機勻漿，勻漿4～6次，每次10 s，勻漿時上下提插，但要保證勻漿機轉(zhuǎn)頭在液面以下，直至無肉眼可見殘渣；將無泡沫層的組織混懸液轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，冰上孵育30 min，其間每10 min震蕩混勻1次；離心機4 ℃預冷30 min后，將組織混懸液置于實驗設(shè)計低溫離心機中，溫度4 ℃，14 000 r/min，離心10 min，收取上清液按實驗設(shè)計分裝完好，置于-80 ℃冰箱環(huán)境保存。為避免蛋白快速降解，以上所有操作均在冰上進行。

1.9.2 BCA蛋白定量 所有試劑室溫放置20 min。準備好BCA工作液，每孔中200 μL BCA工作液，根據(jù)樣本數(shù)及標準孔數(shù)目計算所需要的BCA工作液的總體積；然后將50份A液加入1份B液混合后得到工作液(若看見渾濁，輕度晃動可消失)。取10 μL濃度為5 mg/mL的BSA標準品，用蒸餾水稀釋至100 μL，使其最終濃度為0.5 mg/mL。在96孔板中分別加入0 μL、1 μL、2 μL、4 μL、8 μL、16 μL、20 μL濃度為0.5 mg/mL的標準品，加蒸餾水將溶液補至20 μL。在96孔板中加入20 μL已被稀釋20倍的樣品；標準品孔和樣品孔各加入200 μL BCA工作液，放生化培養(yǎng)箱37 ℃孵育30 min。使用酶標儀在562 nm處測其吸光度值，繪制標準曲線，測出濃度。用超純水調(diào)定蛋白濃度，蛋白樣品最終濃度為0.85 μg/μL。

1.9.3 酶聯(lián)免疫吸附測定MEK濃度 所有試劑室溫放置20 min，從鋁箔袋中取出需要的酶標板板條，根據(jù)需要量配置洗滌液；在紙上布板，確定好標準孔和樣品孔的位置；依據(jù)布板順序，在酶標板標準品孔中各加不同濃度(S0-S5)的標準品50 μL；樣品孔中加入10 μL樣品，再用樣品稀釋液定容至50 μL；空白孔不需要加；每孔各中加入100 μL用辣根過氧化酶標記過的檢測抗體，用封板膜封住，防止污染，放置生化培養(yǎng)箱中37 ℃孵育60 min。倒掉板中液體，在吸水紙上拍干，每孔中加入400 μL的洗滌液，靜置1 min后倒掉洗滌液，再拍干，重復洗5次。每孔中加入A、B兩種底物各50 μL，用封板膜封住，再用鋁箔紙包好，避光，放置生化培養(yǎng)箱中37 ℃孵育15 min。最后，每孔中各加入50 μL的終止液，終止反應(yīng)，用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值(從孵育結(jié)束到開始讀板要在15 min內(nèi)完成)，繪制標準曲線，計算濃度。

2 結(jié) 果

2.1 各組仔鼠一般情況觀察 腎虛質(zhì)模型組較其他各組出現(xiàn)情緒低沉、懶散萎靡、食量降低、體重偏輕、生長發(fā)育遲緩、毛發(fā)稀疏松弛、大便質(zhì)軟或不成形、小便頻多等一系列符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)臨床特點的現(xiàn)象。

2.2 各組海馬MEK蛋白表達比較 與空白對照組比較，腎虛質(zhì)模型組MEK蛋白含量降低(P<0.01)，與腎虛質(zhì)模型組比較，左歸丸組、右歸丸組MEK蛋白含量明顯升高(P<0.05)，左歸丸組和右歸丸組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

組別只數(shù)MEK空白對照組1064.112±7.7652)腎虛質(zhì)模型組1050.500±6.408 左歸丸組1056.517±7.7911)右歸丸組1055.427±4.5631)

與腎虛質(zhì)模型組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

記憶力減退屬中醫(yī)學“善忘”“健忘”“喜忘”等范疇，其病位在腦[10]。腎精，是對腎收藏的精微物質(zhì)的總稱。從經(jīng)絡(luò)學說來看，足太陽膀胱經(jīng)“從巔入腦”，腎與腦通過經(jīng)絡(luò)相連，并在功能上相互協(xié)作，密不可分。腦為髓海，腎為精之府，精水充足則化髓，腦髓足，則神充；反之，腎水匱乏，腦失所養(yǎng)，則神衰健忘[11]。且腎中所藏之精在內(nèi)為人體生骨、化髓、充腦，在外表現(xiàn)為志、作強、主伎巧的功能[12]。而志的主要含義之一就是記憶[13]。

因為補腎中藥對腦有很好的保護作用[14]，并可以通過調(diào)控某些基因的表達來發(fā)揮改善腎虛質(zhì)的作用[15]。有實驗研究發(fā)現(xiàn)，用補腎藥治療腎虛并發(fā)腦缺血動物后，記憶力顯著提高[16]。劉書考[17]研究發(fā)現(xiàn)，補腎方藥可通過下調(diào)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白的含量，抑制長時程記憶的形成。本實驗選取常用藥物左歸丸、右歸丸進行治療觀察，左歸丸為壯水之劑，滋腎補陰，臨床用于治療真陰不足者，表現(xiàn)多為腰酸膝軟，盜汗，神?？谠铮挥覛w丸為益火之劑，溫補腎陽，填精止遺，臨床用于治療腎陽不足，命門火衰者，表現(xiàn)多為腰膝酸冷，怯寒畏冷，陽痿遺精，精神不振。腎虛體質(zhì)主要表現(xiàn)為腎精虧虛，腎精所產(chǎn)生的生理效應(yīng)有腎陰、腎陽兩方面，故本實驗設(shè)有左歸丸、右歸丸兩個組別分別進行研究。

本實驗采用“貓嚇鼠”經(jīng)典方法造模[18]，觀察各組仔鼠一般情況發(fā)現(xiàn)，腎虛質(zhì)模型組較其他各組出現(xiàn)情緒低沉、懶散萎靡、食量降低[19]、體重偏輕、生長發(fā)育遲緩、毛發(fā)稀疏松弛、大便質(zhì)軟或不成形、小便頻多等一系列符合中醫(yī)腎虛體質(zhì)臨床特點的現(xiàn)象[20]，且通過斷頭取腦及酶聯(lián)免疫吸附實驗法發(fā)現(xiàn)腎虛質(zhì)大鼠MEK表達明顯低于左歸丸組、右歸丸組與空白對照組，說明腎虛質(zhì)記憶學習能力與MEK表達有密切關(guān)系。腎虛模型大鼠經(jīng)過左歸丸、右歸丸治療后，MEK表達明顯上升，但左歸丸組與右歸丸組比較治療MEK蛋白差異不明顯，說明補腎方劑可以上調(diào)腎虛質(zhì)大鼠海馬MEK蛋白異常表達，也證明補腎藥物可以通過上調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的MEK表達，改善大鼠學習記憶能力。