腹水草水提液對胃潰瘍大鼠PGE2和COX-2表達的影響＊

張海霞 任偉銘 祁依佳 沈貴芳 趙偉春

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310053）

胃潰瘍是臨床上常見、多發(fā)性疾病。全球每年有1400多萬人被診斷為胃潰瘍，約400萬人死于相關(guān)并發(fā)癥。關(guān)于胃潰瘍的發(fā)病機制，目前被廣泛接受的是攻擊因子和防御因子失衡學(xué)說。胃潰瘍主要攻擊因子有胃酸，腫瘤壞死因數(shù)，內(nèi)皮素等。主要防御因子有NO及NO合成酶，前列腺素（PGs），表皮生長因子等。PGs不在細胞中貯存，一旦機體需要，能很快通過環(huán)氧合酶（COX）反應(yīng)合成。COX-2誘導(dǎo)的直接結(jié)果是以前列腺素E（PGE）為主的PGs產(chǎn)物的合成增加，從而保護胃黏膜。PGE是最重要的胃黏膜保護因子之一，COX是PGs合成過程中重要的限速酶。在明確腹水草水提液抗大鼠乙醇型胃潰瘍的效果的基礎(chǔ)上，本文分析了腹水草水提液對PGE及COX-2的表達的影響，為明確腹水草對抗大鼠乙醇型胃潰瘍的作用途徑提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級SD大鼠48只，6～7周齡，體重180g～220g，雌雄各半，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。腹水草水提液的制備方法見沈貴芳等。RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒（批號：00064478）。PGE2試劑盒（批號：CKE90201R），上海源葉生物科技有限公司。COX-2兔抗鼠多抗（批號：BA0738），武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。β-Actin Antibody和Goat Anti-Rabbit IgG-HRP（均購自艾比瑪特生物醫(yī)藥（上海）有限公司生產(chǎn)。批號分別為：214673和214575）。

1.2 分組、給藥與造模

將48只大鼠按性別分層隨機化分成6組，每組8只。正常組和模型組灌胃生理鹽水（4mL/只）；雷尼替丁組灌胃0.18%雷尼替丁混懸液（0.027g/kg·d，0.0054g/只，臨床劑量的3倍）；腹水草各劑量組分別灌胃高、中、低劑量腹水草水提液(2.8、1.4、0.7g/kg·d，4mL/只)，1次/d，連續(xù)給藥14d。第14d給藥后1h，正常組灌胃1mL/只生理鹽水，其余大鼠均灌胃1mL/只無水乙醇造模，造模前禁食自由飲水24h。

表1 腹水草水提液對PGE2含量的影響（±s，n=8）

圖1 各組大鼠胃黏膜組織COX-2蛋白的Western Blot分析

圖2 名組大鼠胃黏膜組織COX-2//β-actin的蛋白比較

1.3 胃黏膜組織中PGE2的測定

取部分胃組織于0℃下勻漿，于4℃下20000r/min離心20min，取上清液。采用抗體夾心ELISA方法，測定胃黏膜組織中PGE的含量。

1.4 胃黏膜組織中COX-2蛋白的測定

采用RIPA裂解液提取胃黏膜組織蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳采用10%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上進行Western Blot分析。以COX-2/β-actin蛋白條帶的密度比值作為COX-2的相對表達量。

1.5 胃黏膜組織中COX-2 mRNA的測定

采用Trizol試劑提取胃黏膜組織總RNA，經(jīng)非變性瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA的完整性后按照RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis 試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。COX-2的PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；56℃退火30s；72℃延伸1min，30個循環(huán)；72℃充分延伸8min；β-actin的PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min；60℃退火45s；72℃延伸1min，25個循環(huán)；72℃充分延伸10min；PCR擴增結(jié)束經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用凝膠成像系統(tǒng)進行掃描分析，以COX-2/β-actin比值表示各樣本mRNA的相對含量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

圖3 各組大鼠胃黏膜組織COX-2 mRNA的RT-PCR擴增結(jié)果

圖4 各組大鼠胃黏膜組織COX-2/β-actin的mRNA比較

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胃黏膜組織中PGE2含量的比較

結(jié)果見表1。模型組、雷尼替丁組和腹水草各劑量組大鼠胃黏膜組織PGE含量均顯著低于正常組（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。與模型組相比，腹水草各劑量組、雷尼替丁組的PGE含量均顯著提高（

P

＜0.05，

P

＜0.01）。

2.2 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2蛋白含量的比較

模型組、腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠COX-2蛋白的表達量顯著高于正常組（圖1，圖2）。與模型組比較，腹水草各劑量組和雷尼替丁組大鼠的COX-2蛋白水平顯著增加（

P

＜0.01），其中腹水草高劑量組是模型組大鼠的3.9倍，是正常組大鼠的13.2倍。腹水草各劑量組大鼠的COX-2蛋白水平亦顯著高于雷尼替丁組。腹水草低、中、高劑量組間的COX-2蛋白水平亦隨著腹水草劑量的升高而提高（

P

＜0.01）。

2.3 各組大鼠胃黏膜組織中COX-2 mRNA的比較

正常組大鼠胃黏膜組織內(nèi)COX-2 mRNA的表達量最低，COX-2/β-actin為0.071±0.018（圖3，圖4）。腹水草各劑量組、雷尼替丁組和模型組COX-2 mRNA水平均顯著高于正常組，其中腹水草高劑量組是正常大鼠的11.4倍（

P

＜0.01）。雷尼替丁組、腹水草中劑量組和腹水草高劑量組的COX-2 mRNA的表達量高于模型組（

P

＜0.01）。腹水草各劑量組間COX-2 mRNA的表達量差異不顯著（

P

＞0.05）。

3 討論

PGE是最重要的胃黏膜保護因子之一，但其保護胃黏膜的機制尚未闡明。一般認(rèn)為，與其促進黏液及HCO的分泌，改善細胞內(nèi)對H+的中和能力，增加表面疏水性、保護黏膜屏障、調(diào)節(jié)胃黏膜血流量等有關(guān)。已有研究表明，雙蒲散提高潰瘍愈合質(zhì)量的機制可能是增加胃黏膜組織PGE含量，促進黏膜修復(fù)。酒速愈可通過升高胃黏膜PGE含量，加強胃黏膜的黏液—碳酸氫鹽屏障，減輕乙醇對胃黏膜的損傷。腹水草具有去腐生肌和散血逐瘀的作用，本實驗表明，腹水草水提液通過促進胃組織中PGE的合成及釋放來保護胃黏膜。

PGE在體內(nèi)由花生四烯酸(arachidonic acid，AA)所合成。細胞膜磷脂在磷脂酶A的作用下生成花生四烯酸，花生四烯酸在環(huán)氧合酶的作用下生成環(huán)內(nèi)過氧化物前列腺素G(PGG)、前列腺素H(PGH)。PGH很不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)變成前列腺素E(PGE)和血栓素A(TXA)等物質(zhì)。研究認(rèn)為，在正常大鼠胃黏膜組織中，COX-2蛋白幾乎無表達，COX-2 mRNA的表達量很少；但在胃潰瘍發(fā)生或潰瘍愈合的過程中，COX-2蛋白大量表達，COX-2 mRNA的表達量急劇上升。本實驗結(jié)果亦表明，腹水草水提液能提高COX-2 mRNA和COX-2蛋白表達量，促使胃黏膜組織中PGE2含量增加，進而調(diào)節(jié)胃粘液及黏膜血流量，保護黏膜屏障，從而抑制胃潰瘍的發(fā)生。