雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響

厲婷，周和超，陳駒

(1.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部,廣東 湛江 524001； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤中心,廣東 湛江 524001)

口腔癌是人類頭頸部常見的惡性腫瘤之一，其引發(fā)的并發(fā)癥嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)不完全統(tǒng)計，全球平均每年發(fā)病人數(shù)已達(dá)500萬人，其中發(fā)展中國家和貧困地區(qū)人群是主要的患病人群[1]。有研究表明[2]，晚期口腔癌的患者5年存活率高達(dá)30%以上。近年來，隨著全球經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展，人民生活水平的提高，口腔癌的發(fā)病率顯著上升，且發(fā)病人群有年輕化的趨勢[3]。目前手術(shù)治療是臨床上最有效的治療方法，但由于口腔癌起病相對隱匿，往往發(fā)現(xiàn)時已于晚期，錯失了手術(shù)治療的最佳時機(jī)[4]。此外，化學(xué)療法也是口腔癌的重要治療方法，治療藥物有氟尿嘧啶和順鉑等，但現(xiàn)有化療方法不僅毒副作用大，且容易產(chǎn)生耐藥性[5]。故尋找高效低毒的防治口腔癌藥物仍然是科研工作者重中之重的任務(wù)。

雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.F)，性寒、味苦，歸心、肝經(jīng)，其具有消腫止痛、祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、殺蟲解毒的功效[6]。而雷公藤多苷是從雷公藤去皮根部所提取的總苷類化合物，素有“中草藥激素”的美稱，是我國首次研究利用且具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用的中藥提取物，現(xiàn)已有藥物上市[7]。雷公藤多苷的生理活性是由多種成分，如生物堿、三萜、二萜內(nèi)酯等協(xié)同產(chǎn)生，它既保留了雷公藤的免疫抑制活性，又去除了許多毒性成分，故在臨床上應(yīng)用廣泛[8]。目前，雷公藤多苷主要用于治療皮肌炎、多種腎臟疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病和炎癥性疾病[9]。然而，雷公藤多苷對口腔癌的研究目前尚未見相關(guān)實(shí)驗(yàn)報道。本研究旨在探討雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響，初步闡明其作用機(jī)制，為雷公藤多苷抗口腔癌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑

雷公藤多苷片(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，批號：20180302)；細(xì)胞株(人口腔癌KB細(xì)胞，上海素爾生物科技有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；CCK-8、DMSO、RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)液(美國Amresco公司)；Annexin V-FITC /PI 凋亡檢測試劑盒(上海七海復(fù)泰生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(碧云天生物公司)；p-PI3K抗體、p-AKT抗體(美國Santa Cruz公司)；二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific)；Applied Biosystems PCR儀(美國ABI 公司)；BG-sub MIDI 電泳設(shè)備(美國Baygene公司)；Sunrise-Basci 酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(CCK-8法)

人口腔癌KB細(xì)胞采用含10%(φ)胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5%(φ)CO2和飽和濕度條件進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的人口腔癌KB細(xì)胞，采用胰蛋白酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，以100 μL/孔的體積接種于96孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24 h后，分別加入雷公藤多苷各濃度處理，使其終濃度分別為20、40、80、160 μmol/L，其中以0 μmol/L設(shè)定為對照組，每組6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，并孵育5 h，于450 nm 處測定各組吸光度A值，分別計算雷公藤多苷處理24、48、72、96 h 后的細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-A藥物處理組/A對照組]×100%

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(流式細(xì)胞法)

將雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細(xì)胞，于避光條件下分別加入PI和Annexin V/FITC各5 μL，20 min后，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒操作說明書步驟，使用流式細(xì)胞儀測定雷公藤多苷處理組對人口腔癌KB細(xì)胞凋亡率的影響。

2.3 Bcl-2及Bax基因表達(dá)檢測(real-time qPCR法)

將不同濃度雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細(xì)胞，PBS輕輕沖洗2次，提取細(xì)胞總RNA(Trizol法)，并合成cDNA(RT-PCR法)。使用PCR儀檢測Bcl-2及Bax基因表達(dá)情況，其中引物序列分別為Bax:F-5′-CGAATTGGCGAT GAACTGGA-3′，R-5′-CAAACATGTCAGCTGCCA CAC-3′;GAPDH:F-5′-GCACAGTCAAGGCTGAGA ATG-3′，R-5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，Bcl-2:F-5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，R-5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′。

2.4 p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)檢測(Western blot法)

將雷公藤多苷處理48 h后的人口腔癌KB細(xì)胞，先加入細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞總蛋白，再使用BCA蛋白定量試劑盒定量。吸取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，10%胎牛血清封閉液封閉3 h，分別加入p-PI3K、p-AKT一抗4 ℃過夜。PBS洗膜3次后加入二抗，室溫孵育2 h，PBS洗膜后使用ECL試劑分別進(jìn)行化學(xué)發(fā)光、曝光、顯影、定影。Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度分析，以GAPDH為參照。目的蛋白表達(dá)水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

3 結(jié)果

3.1 雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞增殖抑制率的影響

從圖1結(jié)果可知，20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷給藥組分別處理人口腔癌KB細(xì)胞24、48、72、96 h 后，其增殖抑制率均顯著升高，呈濃度和時間依賴性。

3.2 雷公藤多苷對人口腔癌KB 細(xì)胞凋亡的影響

從圖2結(jié)果可知，對照組及20、40、80、160 μmol/L雷公藤多苷組人口腔癌KB細(xì)胞48 h細(xì)胞凋亡率分別為(0.59±0.05)%、(9.34±0.84)%、(9.80±1.02)%、(14.25±2.31)%和(19.23±3.68)%; 與對照組比較，經(jīng)雷公藤多苷處理后的KB 細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.01) 。

20μmol/L40μmol/L80μmol/L160μmol/L35302520151050-5增殖抑制率/%244872960t/h

圖1雷公藤多苷對人口腔癌KB 細(xì)胞增殖抑制率的影響

ABCDE

A.對照組； B.雷公藤多苷20 μmol/L組； C.雷公藤多苷40 μmol/L組； D.雷公藤多苷80 μmol/L組； E.雷公藤多苷160 μmol/L組。

圖2雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞凋亡的影響

3.3 雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果如表1所示，與對照組比較，雷公藤多苷各組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著降低，BaxmRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05或P<0.01)，呈濃度依賴性。

3.4 雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)的影響

與對照組比較，雷公藤多苷組細(xì)胞的p-PI3K和p-AKT 蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，呈濃度依賴性。

表1 雷公藤多苷對人口腔癌KB 細(xì)胞Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)的影響

組別劑量/(μmol·L-1)Bcl-2 mRNABax mRNA對照組-0.73±0.130.47±0.03雷公藤多苷組200.58±0.09?0.62±0.06?400.45±0.07??0.76±0.08??800.36±0.08??0.83±0.12??1600.16±0.05??0.96±0.14??

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

12345p-PI3Kp-AKTGAPDH1.00.80.60.40.20.0p-PI3K表達(dá)12345**************0.60.40.20.0p-AKT表達(dá)AB

1.對照組； 2.雷公藤多苷20 μmol/L組； 3.雷公藤多苷40 μmol/L組； 4.雷公藤多苷80 μmol/L組； 5.雷公藤多苷160 μmol/L組。 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

圖3雷公藤多苷對人口腔癌KB 細(xì)胞p-PI3K(A)和p-AKT(B)蛋白表達(dá)

4 討論

口腔癌是一種由于多種因素(生活方式、環(huán)境因素、遺傳因素等)共同作用所產(chǎn)生的一種惡性程度較高的腫瘤。關(guān)于口腔癌的發(fā)病機(jī)制目前尚未完成闡明，可能與人乳頭瘤病毒感染、不良生活習(xí)慣、抑癌基因失活等有關(guān)[10]。臨床上也無有效應(yīng)對措施，因此探索皮膚癌的發(fā)生機(jī)制以及尋找有效治療藥物是目前亟待解決的問題。

增殖與分化異常是腫瘤細(xì)胞的兩個基本特征，其中抑制腫瘤細(xì)胞異常增殖是評價抗腫瘤藥物效果的一個較為直接的重要指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷對人口腔癌KB細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且在一定劑量濃度范圍，隨著雷公藤多苷濃度的升高和處理時間的延長，對人口腔癌KB細(xì)胞增殖抑制率也隨之升高，呈濃度和時間依賴性。Bcl-2家族主要由抗凋亡基因Bcl-2及促凋亡基因Bax組成，它們也是線粒體凋亡途徑過程中最重要的調(diào)節(jié)因子[12]。Bcl-2主要通過減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用，而Bax主要通過升高線粒體膜通透性和促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放而起到誘導(dǎo)凋亡作用[13]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵蛋白，可直接作為凋亡的效應(yīng)分子，可引起細(xì)胞染色質(zhì)凝集、DNA片段化，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可顯著降低人口腔癌KB細(xì)胞的Bcl-2 mRNA表達(dá)，而顯著升高BaxmRNA表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且呈濃度依賴性，提示了雷公藤多苷可能通過影響線粒體途徑，下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)Bax基因表達(dá)，從而激活Caspase-3的活性，最終引起細(xì)胞的凋亡。

近年來，作為細(xì)胞生存的重要通路，PI3K/AKT信號通路在促進(jìn)增殖、促進(jìn)血管生成、抵抗放化療、侵襲、抑制凋亡等方面受到了廣泛的關(guān)注[16]。多種惡性腫瘤中PI3K/AKT信號通路表達(dá)異常，如肺癌、卵巢癌和乳腺癌等[17]。PI3K是正常人體內(nèi)一種磷脂激酶，由調(diào)節(jié)亞基(p85)和催化亞基(p110)組成，絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT是PI3K主要下游效應(yīng)物。研究發(fā)現(xiàn)AKT在PI3K/AKT信號通路中已擁有100個以上的下游底物，其在調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖和凋亡中起著至關(guān)重要的作用[18]。近期研究表明p-AKT在口腔鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)，提示p-AKT可能參與了口腔癌早期階段的發(fā)生發(fā)展[19]。本研究發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可以明顯降低人口腔癌KB細(xì)胞的p-PI3K 和p-AKT 蛋白表達(dá)水平，且呈濃度依賴性。提示雷公藤多苷通過抑制PI3K/AKT信號通路，從而促進(jìn)人口腔癌KB細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，雷公藤多苷具有抑制人口腔癌KB細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，其作用機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT信號通路的激活有關(guān)。