細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷的保護(hù)作用

王琳，金桂芳，余河漢，陸曉華，尤付玲，楊紅

(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常見的引起癡呆的神經(jīng)退行性疾病。目前全世界約有5 000萬人患有癡呆癥，預(yù)計到2050年這一數(shù)字將達(dá)到1.52億[1]。2018年癡呆癥的總估計費(fèi)用在2018年為1萬億美元，預(yù)計這一數(shù)字到2030年將翻一番[1]。AD的特征在于幾種病理特征，包括老年斑，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和參與學(xué)習(xí)和記憶的腦區(qū)神經(jīng)元丟失[2]。AD是一種多因素疾病，并且已經(jīng)提出了不同的假設(shè)來解釋AD發(fā)病機(jī)理。其中淀粉樣蛋白級聯(lián)假說自20世紀(jì)90年代提出以來已成為主要的一個學(xué)說[3]。研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙與AD相關(guān)，AD患者及小鼠常表現(xiàn)出線粒體功能障礙，同時，β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的活性氧自由基 (reactive oxygen species,ROS)和Ca2+導(dǎo)致線粒體功能障礙，神經(jīng)元能量代謝紊亂，導(dǎo)致神經(jīng)元退化，是AD早期特征，并且在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4-6]。線粒體自噬調(diào)控蛋白PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)和帕金森蛋白2 (Parkin)監(jiān)測線粒體的功能狀態(tài)，在正常的線粒體中,PINK1會被線粒體相關(guān)酶以及蛋白連續(xù)降解,但在功能損傷尤其是膜電位下降的線粒體中,PINK1轉(zhuǎn)位被抑制,使其在線粒體外膜累積,PINK1與外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶形成復(fù)合物,發(fā)生磷酸化[7]。磷酸化的PINK1磷酸化Parkin,促進(jìn)Parkin從胞漿移位到受損的線粒體,介導(dǎo)線粒體自噬的發(fā)生[7]。

遠(yuǎn)志始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWilld.的干燥根,具有安神益智、改善認(rèn)知缺陷、提高記憶力、抗抑郁等作用[8]。細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷是遠(yuǎn)志的主要活性成分，其能改善AD鼠記憶障礙[9-10]，減少AD模型細(xì)胞中Aβ的分泌[11]。本研究旨在探討細(xì)葉遠(yuǎn)志皂苷(Tenuifolin,Ten)對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及線粒體功能的潛在聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

SH-SY5Y細(xì)胞(廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供)；Ten(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)；Aβ25-35 (Sigma公司)；MTT(廣州翔博生物科技有限公司)；Parkin-siRNA (上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；caspase-3活性檢測試劑盒、caspase-9活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；引物(生工生物工程股份有限公司)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)；LC3B抗體(Abcam公司，ab48394)；Rabbit anti-β-actin、Goat anti-rabbit IgG (γ-chain specific) (博士德公司)；環(huán)胞霉素A(CsA,生工生物工程股份有限公司)；ELx800酶標(biāo)儀 (Biotek)；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡 (Zeiss)；CFX ConnectTM實(shí)時熒光定量PCR (Real-time PCR) 檢測系統(tǒng)(美國伯樂公司)；GeneGnome XRQ型凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.2 Aβ25-35準(zhǔn)備

用1.8 mL重蒸水將1 mg Aβ25-35溶解成濃度為500 μmol/L的母液,于37 ℃下孵育7 d以形成聚集形式的Aβ25-35,-20 ℃冷凍保存?zhèn)錅y,測量前用培養(yǎng)基稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.3 siRNA制備

將合成的Parkin-siRNA和Negative control(NC)siRNA粉末用附送的DEPC水溶解，配置成20 μmol/L的樣品儲存液，分裝-20 ℃保存。用培養(yǎng)基稀釋適量體積的Parkin-siRNA，配制成含20 nmol/L Parkin-siRNA溶液的培養(yǎng)基。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞在含有10%(φ)的胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液中，37 ℃、5%(φ) CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。每2～3天0.25%胰酶消化傳代1次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，以6×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并且每組設(shè)置5個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)。24 h后加入Ten終濃度分別為0、25、50、100、200 μmol/L處理2 h，再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35處理24 h，然后加入5 mg/mL MTT工作液，10 μL/孔，37 ℃孵育4 h后吸棄培養(yǎng)液，并在各孔內(nèi)加入150 μL DMSO，放置搖床上低速搖晃10 min，使結(jié)晶充分溶解，使用酶標(biāo)儀測490 nm波長下各孔的吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，根據(jù)測得的A值計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

1.6 caspase-3和caspase-9酶活力檢測

SH-SY5Y細(xì)胞用Ten終濃度50 μmol/L處理2 h，再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35處理24 h。細(xì)胞收集后用PBS洗滌，加入裂解液后冰浴15 min，4 ℃ 12 000g離心10 min后取上清液，用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。按照caspase-3和caspase-9活性檢測試劑盒設(shè)置反應(yīng)體系。加入檢測緩沖液、待測樣品和Ac-DEVD-pNA(2 mmol/L)混勻，37 ℃孵育1～2 h，用酶標(biāo)儀測定405 nm波長下的吸光度值，caspase-3和caspase-9酶活力以各實(shí)驗(yàn)組的吸光度與對照組細(xì)胞的吸光度之比值表示(A比值)。

1.7 RT-qPCR分析

SH-SY5Y細(xì)胞用Ten終濃度為50 μmol/L和Parkin-siRNA終濃度20 nmol/L處理2 h，再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35處理24 h。用Trizol提取細(xì)胞中的總RNA，取2 μL樣品用用微量紫外/可見分光光度計測A260/280及RNA濃度。按照TaKaRa的PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以得到cDNA。然后，取cDNA按照SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書，在CFX Connect熒光定量PCR儀上進(jìn)行Real Time PCR反應(yīng)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.8 Western blot檢測細(xì)胞Cyt C及LC3蛋白水平

SH-SY5Y細(xì)胞用Ten終濃度50 μmol/L處理2 h，用CsA終濃度5 μmol/L處理2 h,再加入終濃度為20 μmol/L的Aβ25-35處理。培養(yǎng)24 h后用RIPA裂解液(含1 mmol/L PMSF)提取總蛋白，4 ℃，12 000g離心10 min，取上清，BCA蛋白檢測試劑盒測蛋白濃度，制備電泳樣品，用5%濃縮膠，12%分離膠，80 V 30 min，120 V 60 min SDS-PAGE電泳樣品，200 mA濕轉(zhuǎn)1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃分別孵育Cyt C、LC3B抗體過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。ECL化學(xué)反光顯影，曝光，掃描。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

結(jié)果表明，Aβ模型組SH-SY5Y細(xì)胞存活率明顯降低，不同濃度(25～200 μmol/L)Ten+Aβ組細(xì)胞活力顯著高于Aβ模型組(圖1)。

120100806040200**########細(xì)胞存活率/%123456

1. control; 2. Aβ(20 μmol/L); 3. Ten (25 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 4. Ten (50 μmol/L)+Aβ(20 μmol/L); 5. Ten(100 μmol/L)+Aβ(20 μmol/L); 6. Ten (200 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L)。與control比較:**P<0.01；與Aβ組比較:##P<0.01。

圖1Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

2.2 Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ模型組顯著增加caspase-3和caspase-9酶活力和mRNA表達(dá)水平；與Aβ模型組相比，Ten和siRNA明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-9酶活力和mRNA表達(dá)水平(圖2)。

123caspase-3caspase-9****####酶活性/%2.01.51.00.50.01234567caspase-3mRNA相對表達(dá)3210#####**1234567543210##########**ABcaspase-9mRNA相對表達(dá)

A. caspase-3和caspase-9酶活力結(jié)果(1. control; 2. Aβ 20 μmol/L; 3. Ten 50 μmol/L+Aβ 20 μmol/L); B.caspase-3和caspase-9 基因表達(dá)水平直方圖(1. control; 2. Ten 50 μmol/L; 3. Aβ 20 μmol/L; 4. Ten 50 μmol/L+Aβ 20 μmol/L; 5. siRNA 20 nmol/L; 6. siRNA 20 nmol/L+Aβ 20 μmol/L; 7. Ten 50 μmol/L+siRNA 20 nmol/L+Aβ 20 μmol/L)。與control比較:**P<0.01；與Aβ組比較:#P<0.05,##P<0.01。

圖2Ten和siRNA對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的影響

2.3 Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Cyt C蛋白水平的影響

CsA可通過阻斷線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，調(diào)節(jié)線粒體功能。圖3結(jié)果表明，與對照組比，Aβ模型組胞質(zhì)Cyt C水平顯著增加；與Aβ模型組比，Ten+Aβ、 CsA+Aβ和Ten+CsA+Aβ組胞質(zhì)Cyt C水平明顯減少。結(jié)果表明，Ten和CsA能明顯抑制Aβ誘導(dǎo)的Cyt C的釋放。

12345672.01.51.00.50.0相對蛋白表達(dá)量1234567Cytcβ-actinBA##########**

A．Cyt C蛋白的Western blot結(jié)果顯影圖； B. Cyt C蛋白表達(dá)水平直方圖；1. control; 2. Ten (50 μmol/L); 3. Aβ(20 μmol/L); 4. Ten (50 μmol/L)+Aβ(20 μmol/L); 5. CsA (5 μmol/L); 6. CsA (5 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 7. Ten (50 μmol/L)+CsA (5 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L)。與control組比較:**P<0.01；與Aβ組比較:##P<0.01。

圖3Ten和CsA對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞Cyt C蛋白表達(dá)的影響

2.4 Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)的PINK1和Parkin mRNA表達(dá)水平的影響

結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ模型組能顯著增加PINK1和Parkin mRNA的表達(dá)水平；與Aβ模型組相比，Ten和siRNA組明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)PINK1和Parkin mRNA的表達(dá)水平(圖4)。結(jié)果表明，Ten和siRNA能明顯降低Aβ誘導(dǎo)的PINK1和Parkin mRNA表達(dá)水平。

2.5 Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)自噬標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)水平的影響

圖5 Western blot檢測LC3 II/I結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ模型組LC3 II/I比值顯著增加，與Aβ模型組相比，Ten和CsA組明顯抑制Aβ誘導(dǎo)的LC3 II/I的增加。LC3 II/I是自噬的標(biāo)志物之一，結(jié)果表明，Aβ誘導(dǎo)自噬增加，且Ten和CsA能抑制Aβ誘導(dǎo)的自噬增加。

1234567PINK1mRNA表達(dá)1.51.00.50.03.02.52.01.51.00.50.01234567########*#####**BAParkinmRNA表達(dá)

A．PINK1 mRNA表達(dá)水平直方圖；B. Parkin mRNA表達(dá)水平直方圖；1. control; 2. Ten (50 μmol/L); 3. Aβ (20 μmol/L); 4. Ten (50 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 5. siRNA (20 nmol/L); 6. siRNA (20 nmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 7. Ten (50 μmol/L)+siRNA (20 nmol/L)+Aβ (20 μmol/L)。與control組比較:*P<0.05,**P<0.01；與Aβ組比較:#P<0.05,##P<0.01。

圖4Ten和siRNA對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞PINK1和Parkin mRNA的影響

BALC3ILC3II12345672.01.51.00.50.0LC3II/I比率1234567########**

A. LC3 II/I蛋白的Western blot結(jié)果顯影圖; B. LC3-II/I蛋白表達(dá)水平直方圖；1. control; 2. Ten (50 μmol/L); 3. Aβ (20 μmol/L); 4. Ten (50 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 5. CsA(5 μmol/L); 6. CsA (5 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L); 7. Ten (50 μmol/L)+CsA (5 μmol/L)+Aβ (20 μmol/L)。與control組比較:**P<0.01；與Aβ組比較:##P<0.01。

圖5Ten和CsA對Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞LC3蛋白表達(dá)的影響

4 討論

原發(fā)性老年癡呆癥又稱AD，是慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。線粒體功能障礙是AD病人腦部早期出現(xiàn)的病理特征之一[12]，研究表明[13-17]，AD患者及動物模型的細(xì)胞線粒體存在電子傳遞鏈損傷、線粒體DNA突變等，與氧化應(yīng)激、Aβ沉積等病理改變相互促進(jìn)，加劇AD病理損傷。Aβ可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞線粒體損傷致使線粒體膜電位(Δψm)下降，通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，使位于線粒體內(nèi)膜間隙的Cytc等釋放至胞漿中，并在dATP 存在下與凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合形成多聚體，激活caspase-9，繼而活化下游效應(yīng)器caspase-3，啟動caspase 的級聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18-19]。本研究顯示，Aβ模型組細(xì)胞活力下降，同時胞漿Cyt C蛋白水平增加，caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表達(dá)水平升高，而Ten處理后，細(xì)胞活力增加，同時明顯抑制了Aβ誘導(dǎo)的Cyt C釋放，降低了caspase-3和caspase-9酶活力及mRNA的表達(dá)水平，提高了SH-SY5Y細(xì)胞的活力。結(jié)果表明Ten能通過改善Aβ25-35誘導(dǎo)后線粒體功能損傷，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

線粒體功能正常時，由于膜電壓的抑制，PINK1被迅速降解，當(dāng)線粒體膜電位去極化后，PINK1才以電壓依賴的方式在線粒體外膜上穩(wěn)定表達(dá)[20]。PINK1通過其激酶活性磷酸化Parkin，使Parkin定位于膜電位下降的線粒體[21]，PINK1和Parkin共同監(jiān)測線粒體的功能狀態(tài)[22]，啟動線粒體自噬。CsA通過阻斷線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔，調(diào)節(jié)線粒體功能及細(xì)胞存亡[23]。本研究顯示，用Parkin siRNA 干擾Parkin基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Aβ模型組PINK1和Parkin的mRNA表達(dá)水平增加，而Ten和Parkin siRNA組顯著抑制了Aβ誘導(dǎo)的PINK1和Parkin的mRNA表達(dá)水平，Parkin siRNA組也明顯下調(diào)了Aβ25-35刺激引起的caspase-9 mRNA的表達(dá)，Ten和CsA組明顯抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的Cyt C和LC3-II/I的表達(dá)水平增加，提示Ten具有與CsA相似的作用，減輕線粒體損傷。

本研究結(jié)果顯示，Ten對Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞線粒體損傷具有明顯的保護(hù)作用。Ten為多途徑、多靶點(diǎn)作用的藥物，是治療AD的潛在藥物