HPLC法同時(shí)測(cè)定炎立消膠囊中5種成分的含量

張妤琳 ，沈曄

(1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210019； 2.嘉興市第一醫(yī)院，浙江 嘉興 314000)

炎立消膠囊是以丁香葉為原料提取制得的膠囊劑，具有清熱解毒、消炎止痢等功效，臨床上用于屬于熱癥的細(xì)菌性痢疾、急性扁桃體炎、急慢性支氣管炎、急性腸胃炎、急性乳腺炎等感染性疾病[1-6]。丁香葉為木犀科丁香屬植物紫丁香SyringaoblateLindl.、朝鮮丁香SyringadiatataNakai.或洋丁香SyringavulgarisL.的干燥葉，該屬植物為落葉灌木，在東北地區(qū)分布較廣，資源豐富，是庭院綠化的主要樹種。研究表明，丁香葉是一種理想的廣譜抗菌藥，具有顯著的抗菌消炎作用，所含的有效成分主要有有機(jī)酸類、苷類以及揮發(fā)油等，其中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、咖啡酸、紫丁香苷、丁香苦苷等具有較強(qiáng)的抑菌作用，為其主要活性物質(zhì)[7-11]。炎立消膠囊現(xiàn)行的法定標(biāo)準(zhǔn)大部分只有原兒茶酸的含量測(cè)定項(xiàng)，且多為紫外分光光度法，專屬性和準(zhǔn)確性都較差[12]。目前對(duì)炎立消膠囊多組分同時(shí)測(cè)定的報(bào)道較少，且包含的組分不夠全面[13-14]，為進(jìn)行有效的質(zhì)量控制，更全面合理地評(píng)價(jià)該制劑的整體質(zhì)量，我們建立了HPLC同時(shí)測(cè)定炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷和咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法。

1 儀器與試藥

LC-20AB高效液相色譜儀，LC solution色譜工作站(日本島津公司，PDA檢測(cè)器)；KH-700TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾超超聲儀器有限公司)；BS21S 型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

原兒茶酸(批號(hào)100049-201009，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)，原兒茶醛(批號(hào)110810-201608，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%)，酪醇(批號(hào)111676-200602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%)，紫丁香苷(批號(hào)111574-201605，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.2%)，咖啡酸(批號(hào)110885-201703，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；炎立消膠囊15批[葵花藥業(yè)集團(tuán)(吉林)臨江有限公司，批號(hào)20170201、20170701、20180202；吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)170901、171201、180202；通化斯威藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)171001、171201、180101；修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)171104、180105、180301；黑龍江龍桂制藥有限公司，批號(hào)171102、171201、180101]。硬脂酸鎂由葵花藥業(yè)集團(tuán)(吉林)臨江有限公司提供。甲醇、冰醋酸均為色譜純，水為去離子水，其余均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸對(duì)照品25.890、5.105、50.400、25.340、5.083 mg，精密稱定，分別置于100、100、50、100、100 mL容量瓶中，用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.258 6、0.050 7、1.008 0、0.241 2、0.050 7 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

精密量取原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸各對(duì)照品儲(chǔ)備溶液2、5、5、2、1 mL置于50 mL量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，即得質(zhì)量濃度分別為10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品0.5 g，置錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率35 kHz)，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備

炎立消膠囊處方為丁香葉單味藥，取輔料硬脂酸鎂0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，制得不含丁香葉的陰性對(duì)照溶液。

2.2 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Agela Durashell RP C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm)；以甲醇為流動(dòng)相A，以1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)冰醋酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫：0～20 min，8%A；20～30 min，8%A→15%A；30～40 min，15%A→20%A；40～50 min，20%A→8%A。流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷檢測(cè)波長為275 nm，咖啡酸檢測(cè)波長為322 nm。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定。5種成分與相鄰峰之間分離度均大于1.5，陰性對(duì)照對(duì)測(cè)定無干擾，見圖1。

100806040200mAU1008060402001008060402005040302010012435123541015202530354005101520253035400510152025303540051015202530354005ABCDt/mint/mint/mint/min

1.原兒茶酸； 2.原兒茶醛； 3.酪醇； 4.咖啡酸； 5.紫丁香苷；A.對(duì)照品溶液(275 nm)； B.對(duì)照品溶液(322 nm)； C.供試品溶液(275 nm)； D.供試品溶液(322 nm)。

圖1炎立消膠囊多組分測(cè)定的HPLC色譜圖
Figure1HPLC Chromatograms of Yanlixiao capsules

2.4 線性關(guān)系的考察

精密量取“2.1.1”項(xiàng)下原兒茶酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.02、0.2、0.4、2、5、10 mL，原兒茶醛對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、1、2、5、10、15 mL，酪醇對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.5、1、2.5、5、7.5、10 mL，紫丁香苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.2、0.5、1、2、5、10 mL，咖啡酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.5、1、2.5、5 mL，分別置于50 mL量瓶中，用50%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇稀釋至刻度，即得系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取各混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的回歸方程分別為A=1.647 5×104ρ-8.770 7×102(r=0.999 9)、A=3.967 9×104ρ-1.396 6×103(r=0.999 9)、A=5.781 1×103ρ+2.826 5×103(r=0.999 9)、A=1.823 0×104ρ-1.617 4×103(r=0.999 9)、A=5.035 3×104ρ+6.700 7×102(r=0.999 9)。結(jié)果表明，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸在0.103 5～51.728 2、0.101 4～15.207 8、10.08～201.6、0.964 9～48.247 4、0.101 4～5.067 8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批炎立消膠囊(批號(hào)20170701)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g，RSD值(n=6)分別為0.9%、1.6%、1.6%、1.4%和1.1%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液(原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸質(zhì)量濃度分別為10.345 6、5.069 3、100.800 0、9.649 5、1.013 6 mg/mL)，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色譜峰面積的RSD值(n=6)分別為0.2%、0.2%、0.2%、0.2%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批炎立消膠囊(批號(hào)20170701)，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸色譜峰面積的RSD值(n=8)分別為0.7%、1.1%、0.8%、0.9%、0.8%，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的炎立消膠囊(批號(hào)20170701，原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.507 3、0.034 3、1.963 1、0.704 4、0.204 6 mg/g)6份，每份精密稱取0.25 g，置錐形瓶中，分別精密加入“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液原兒茶酸0.5 mL、原兒茶醛0.15 mL、酪醇0.5 mL、紫丁香苷0.7 mL、咖啡酸1 mL，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min(功率250 W，頻率35 kHz)。放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的平均加樣回收率分別為98.9%、98.8%、101.1%、101.3%、95.2%，RSD值(n=6)分別為2.8%、1.3%、3.0%、4.0%、2.1%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.9 樣品測(cè)定

取15批炎立消膠囊，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行制備供試品溶液2份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。

3 討論

炎立消膠囊中原兒茶酸、原兒茶醛、酪醇、紫丁香苷、咖啡酸的最大吸收波長分別為260、280、275、265、322 nm，綜合考慮，選擇雙波長275、322 nm進(jìn)行測(cè)定。

比較了乙腈-0.1%H3PO4系統(tǒng)和甲醇-1%冰醋酸溶液系統(tǒng)，以及3種色譜柱[Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent Zorbax SB-Aq C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Phenomex Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)]，結(jié)果在使用Agela Durashell RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱、流動(dòng)相為甲醇-1%冰醋酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫時(shí)，5種成分分離最佳，色譜行為良好。

表1 炎立消膠囊中5種成分的加樣回收率結(jié)果Table 2 1 The recoveries of five constituents in Yanlixiao capsules (n=6)

表2 炎立消膠囊中5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果

Table2The content of five constituents in Yanlixiao capsules (n=2)w/(mg·g-1)

編號(hào)生產(chǎn)企業(yè)批號(hào)原兒茶酸原兒茶醛酪醇紫丁香苷咖啡酸S1葵花藥業(yè)集團(tuán)(吉林)臨江有限公司201702010.793 3 0.058 4 3.410 3 1.179 4 0.325 7 S2201707010.507 3 0.034 3 1.963 1 0.704 4 0.204 6 S3201802020.525 3 0.027 4 2.721 6 0.655 4 0.193 8 S4吉林省正和藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司1709010.387 7 0.050 8 3.498 6 0.373 2 0.036 4 S51712010.324 4 0.045 1 3.167 0 0.529 5 0.044 3 S61802020.343 7 0.032 9 4.745 2 0.553 5 0.079 1 S7通化斯威藥業(yè)股份有限公司1710010.310 9 0.039 6 0.921 7 0.691 7 0.122 8 S81712010.334 0 0.040 0 0.801 3 0.587 6 0.120 9 S91801010.511 9 0.031 2 1.957 0 0.483 2 0.110 6 S10修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司1711040.281 6 0.038 5 3.865 0 0.384 5 0.102 1 S111801050.315 2 0.023 5 2.566 3 0.435 2 0.075 1 S121803010.398 7 0.030 6 3.122 6 0.362 2 0.072 6 S13黑龍江龍桂制藥有限公司1711020.174 1 0.028 4 0.841 1 0.659 6 0.069 1 S141712010.358 1 0.036 8 1.025 6 0.460 3 0.109 9 S151801010.356 1 0.022 3 1.060 4 0.433 4 0.138 8

比較了不同提取方法(超聲以及加熱回流提取)、不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、80%甲醇)、不同提取時(shí)間(15、30、45 min)的提取效果，最終，選擇了50%甲醇超聲提取30 min作為供試品溶液制備方法。

目前,炎立消膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)大多以原兒茶酸做參照，供試品溶液采用索氏提取法制備，采用紫外分光光度法測(cè)定，得到的是酚酸類成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和，其專屬性不夠，不能準(zhǔn)確全面地表征該制劑各有效成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)[12]。此外，炎立消膠囊標(biāo)準(zhǔn)中丁香葉來源于3個(gè)種(紫丁香、朝鮮丁香、洋丁香)，各個(gè)種中原兒茶酸等5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高低有所不同。從測(cè)定結(jié)果來看，5種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)并非呈現(xiàn)正相關(guān)性，而是有高有低，例如S1樣品中原兒茶酸、原兒茶醛、紫丁香苷、咖啡酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均最高，而酪醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)略高于均值，S6樣品中酪醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其余成分則處于均值附近，S12樣品紫丁香苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，但其余4種成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)并不低，處于均值上下，提示我們各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的差異應(yīng)與各企業(yè)投料的丁香葉種屬密切相關(guān)。制劑的療效是其各有效成分的協(xié)同綜合作用，僅以某一成分來評(píng)價(jià)顯然不夠合理，本文方法可進(jìn)一步用來探索丁香葉各個(gè)種屬間各有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性，從而有效指導(dǎo)投料藥材以及更全面合理有效地評(píng)價(jià)該產(chǎn)品質(zhì)量。