道地藥材平江白術(shù)揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究

李然，李靜，童巧珍，徐長瓊，唐奇，夏麗瓊，黃妍君，李旭富，黎春輝

(1．岳陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 岳陽 414000； 2．廣州中醫(yī)藥大學中藥學院，廣東 廣州 510006； 3.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208； 4.汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭 515041； 5.北京同仁堂平江白術(shù)有限公司，湖南 岳陽 414000)

白術(shù)藥材為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，又名“冬術(shù)”“浙術(shù)”“于術(shù)”，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于治療脾虛食少、腹脹腹瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安[1]，主產(chǎn)于湖南、浙江、安徽、湖北、江西、四川等地。產(chǎn)于湖南平江縣者，稱為“平江白術(shù)”，俗稱“平術(shù)”，平江白術(shù)有400多年的種植歷史，早在明朝嘉靖年間，《本草綱目》中即有云：“白術(shù)瘦而黃者是幕阜山所出”，幕阜山位于今湖南省岳陽市平江縣。清代同治《平江縣志》物產(chǎn)篇盛贊“平術(shù)最著名”，因平江白術(shù)品質(zhì)較佳，在國內(nèi)外藥材市場享有盛譽。

目前，關于平江白術(shù)的研究多集中在栽培技術(shù)方面，如朱校奇等[2]制定了栽培技術(shù)規(guī)程，宋英等[3]闡述了連作障礙的原因及其消除途徑，但未見平江白術(shù)質(zhì)量評價相關報道。白術(shù)的化學成分主要有揮發(fā)油、內(nèi)酯類、苷類、多糖類、氨基酸等成分，而白術(shù)揮發(fā)油為其抗癌[4]、修復胃黏膜[5]、抑菌[6]等多重藥效的物質(zhì)基礎。本實驗擬在用GC-MS法對平江白術(shù)揮發(fā)油成分鑒定分析的基礎上，建立道地藥材平江白術(shù)揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜，為其質(zhì)量評價提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

DFT-200型手提式高速萬能粉粹機(溫嶺市林大機械有限公司)；BSA224S-CW型電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司]；揮發(fā)油提取器；98-I-B型電子調(diào)溫電熱套(天津泰斯特儀器有限公司)；7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(安捷倫公司)。

15批平江白術(shù)樣品分別于湖南省平江縣龍門鎮(zhèn)、長壽鎮(zhèn)、加義鎮(zhèn)、平江縣城、北京同仁堂等進行收集，由湖南中醫(yī)藥大學藥學院童巧珍教授鑒定為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，具體來源情況見表1。蒼術(shù)酮對照品(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號180621，質(zhì)量分數(shù)≥98.0%)；無水Na2SO4(廣東光華科技股份有限公司，批號20171120，分析純)；三氯甲烷(廣州化學試劑廠，批號20160202-2，分析純)。

表1 15批平江白術(shù)樣品來源信息

Table1Samples source information of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

編號來源編號來源S1平江龍門鎮(zhèn)新和村S9平江加義鎮(zhèn)楊林街村S2平江龍門鎮(zhèn)純良村S10平江加義鎮(zhèn)麗江村S3平江龍門鎮(zhèn)源里村S11平江加義鎮(zhèn)楊林街村S4平江龍門鎮(zhèn)大漁村S12平江長壽鎮(zhèn)白沿村S5平江龍門鎮(zhèn)豐福村S13平江縣城S6平江龍門鎮(zhèn)福壽村S14平江縣城S7S8平江龍門鎮(zhèn)河仙村平江龍門鎮(zhèn)渣平村S15北京同仁堂平江白術(shù)有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取蒼術(shù)酮對照品適量，精密稱定，置2 mL容量瓶中，加入三氯甲烷溶解，定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取15批平江白術(shù)藥材，各100 g，敲碎，再用粉碎機打碎，過2號篩。置1 000 mL圓底燒瓶中，加水500 mL，浸泡3 h，參照2015年版《中國藥典》“揮發(fā)油測定法”提取平江白術(shù)揮發(fā)油。連續(xù)提取5 h，得油狀物，冷卻放置2 h后，讀數(shù)并收集揮發(fā)油，加適量無水Na2SO4脫水。取揮發(fā)油20 μL，至2 mL棕色量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 GC-MS條件

2.3.1 氣相色譜條件 HP-5 MS(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛細管柱，程序升溫：柱初始溫度為100 ℃，以3 ℃/min升至130 ℃，保留10 min，再以6 ℃/min升至250 ℃。進樣量為0.1 μL；分流比為50∶1；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純度He(99.999%)。

2.3.2 質(zhì)譜條件 EI離子源；離子源溫度為230 ℃；電離能量為70 eV；四極桿溫度為150 ℃；EM電壓2 165 V；接口溫度為280 ℃；溶劑延遲3 min；掃描質(zhì)量范圍m/z40～550。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度考察 取S15供試品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取0.1 μL，按“2.3”項下GC-MS條件，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004年A版)”(簡稱“相似度評價系統(tǒng)”)計算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰的相對峰面積的RSD值均<2.00%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性考察 取S15供試品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣0.1 μL，所得圖譜運用相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰的相對峰面積的RSD值均<2.00%，表明各樣品成分在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復性考察 取S15供試品，分別按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液，并按“2.3”項下條件分析，所得圖譜運用相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結(jié)果均為1.000，其中共有峰相對峰面積的RSD均<2.00%(范圍：0.00%～0.62%)，表明本方法重復性良好，符合指紋圖譜要求。

2.5 指紋圖譜的建立及共有峰的鑒定

按“2.3”項下GC-MS條件，對15批平江白術(shù)供試品揮發(fā)油進行分析，測得GC-MS總離子流圖。將積分后圖譜數(shù)據(jù)導入相似度評價系統(tǒng)進行處理分析，建立平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜共有模式，見圖1。各批平江白術(shù)揮發(fā)油總離子流圖疊加圖見圖2。

1.280.960.640.320?107豐度12182430364206t/min1.蒼術(shù)酮。1.280.960.640.320?107豐度12182430364206AB11

圖115批平江白術(shù)藥材GC-MS指紋圖譜共有模式(A)及對照品(B)圖譜

Figure1The maps of GC-MS fingerprint common pattern of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang (A)and the reference(B)

在平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜中，共標定出17個共有指紋峰，其中16號峰(蒼術(shù)酮)為對照，其他16個共有指紋峰的相對保留時間依次為0.434、0.443、0.452、0.462、0.471、0.491、0.513、0.544、0.598、0.659、0.686、0.709、0.730、0.750、0.910、1.690，各共有峰相對保留時間RSD均<0.20%(范圍：0.00%～0.12%)；17個共有指紋峰的總面積占GC-MS檢出的平江白術(shù)揮發(fā)油總峰面積的90%以上。

通過NIST14標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，并查閱相關文獻[7]，分析平江白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜中共有峰成分，分析結(jié)果見表2。

1.280.960.640.320?107豐度12182430364206t/minS15S1

S1～S15. 表1中S1-S15樣品。

圖215批平江白術(shù)供試品的GC-MS指紋圖譜疊加圖

Figure2The Overlay map of GC-MS fingerprint of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

2.6 相似度分析

將15批平江白術(shù)指紋圖譜數(shù)據(jù)導入相似度評價系統(tǒng)，以共有模式圖譜為對照，計算各批白術(shù)揮發(fā)油圖譜與共有模式圖譜的相似度，結(jié)果15批白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜與共有模式對照指紋圖譜的相似度分別為0.999、0.989、0.999、1.000、0.999、1.000、1.000、0.999、0.999、1.000、0.921、0.998、1.000、0.994、0.999。有93.33%的供試品相似度在0.980以上，其中相似度最低者為S11，可見平江白術(shù)化學成分相似度較高，但質(zhì)量存在一定差異。

2.7 聚類分析

以17個共有峰峰面積為變量，運用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對15批平江白術(shù)樣品進行聚類分析，采用組間鏈接，以值向量的余弦作為樣品相似度的測度，結(jié)果見圖3。當分類距離為5時，可分為2類，供試品S8、S15、S5、S10、S13、S12、S1、S9、S6、S7、S3、S4、S2、S14為一類，S11為一類，聚類趨勢與相似度結(jié)果基本一致，二者分析結(jié)果可相互驗證。

2.8 主成分分析

運用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件對17個共有峰的峰面積進主成分分析，得到相關特征值及其方差，見表3。根據(jù)特征值與方差累積貢獻率，共提取了5個主成分，方差累積貢獻率達89.323%，可代表平江白術(shù)藥材指紋圖譜共有峰的大部分信息。

表2 平江白術(shù)揮發(fā)油共有成分分析Table 2 Analysis of common components in the essential oil of Atractylodes macrocephala Koidz. produced in Pingjiang

S8S15S5S10S13S12S1S9S6S7S3S4S2S14S111015202505

圖315批平江白術(shù)藥材聚類分析樹狀圖

Figure3Cluster analysis dendrogram of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

表3 平江白術(shù)中17個共有峰的主成分特征值及方差

Table3Principal component eigenvalues and variances of 17 common peaks ofAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分特征值方差貢獻率/%方差累積貢獻率/%16.35037.35637.35623.52220.71758.07332.37713.98072.05341.6509.70381.75751.2867.56689.323

主成分載荷矩陣反映了各變量對主成分的貢獻大小和作用方向。17個共有峰對5個主成分影響的得分圖見圖4。由圖4可知，除共有峰7、11、13、16、17對主成分1呈負相關，其余均為正相關，其中共有峰1、2、4、5、6、8、9、10、12對主成分1的貢獻最大；17個變量對主成分2多為正相關，共有峰3、7、8、11、13、14、16、17對主成分2貢獻最大，其中共有峰5、7、11、17與主成分2呈負相關；共有峰10、12、14、15對主成分3貢獻最大；共有峰7、11、13、17對主成分4貢獻最大；共有峰3對主成分5貢獻最大，且與主成分5呈負相關。

進一步將各特征向量中心化和標準化后，15批平江白術(shù)樣品的主成分排序坐標圖見圖5。由圖5可知，第1主成分得分最高的為S2，第2主成分得分最高的為S5，第3主成分得分最高的為S14，第4主成分得分最高的為S11，第5主成分得分最高的為S7。以第1、2、3主成分得分做三維散點圖，見圖6?？蓪?5批平江白術(shù)分為3類，其中S1、S2、S5、S6、S8、S10、S12、S14聚為一類，S3、S4、S7、S9、S13、S15聚為一類，S11聚為一類，此結(jié)果與相似度分析、聚類分析基本一致。

圖4平江白術(shù)中共有峰5個主成分得分圖

Figure4The map of 5 principal component scores of common peaks inAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

圖515批平江白術(shù)中5個主成分的排序坐標圖

Figure5The sorting graph of five principal components of 15 batchesAtractylodesmacrocephalaKoidz. produced in Pingjiang

主成分2主成分11.00.50.0-0.5-1.0-1.0-0.50.00.51.01.00.50.0-0.5-1.0主成分3

圖6主成分得分三維散點圖

Figure6Principal component score three-dimensional scatter map

3 討論

本實驗運用2015年版《中國藥典》中的揮發(fā)油提取方法，提取了15批平江白術(shù)的揮發(fā)油。通過對色譜圖的出峰數(shù)量、各峰分離度與豐度為指標進行測試條件考察，最終確定目前所用測試條件。方法學考察表明，使用該方法確定的平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜準確可靠，為評價平江白術(shù)質(zhì)量提供重要參考。

不同批次平江白術(shù)中均含蒼術(shù)酮等17種成分，占藥材揮發(fā)性成分的90%以上，具顯著代表性，故以此17種成分建立平江白術(shù)揮發(fā)油指紋圖譜。但以上17種成分的種類和相對質(zhì)量分數(shù)是否為平江白術(shù)的特征，仍需與更大樣本量的非平江產(chǎn)白術(shù)進一步分析比較。

本試驗初步確立了平江白術(shù)揮發(fā)油GC-MS指紋圖譜的分析方法，建立了平江白術(shù)指紋圖譜。該方法簡單、可操作性強，可初步用于平江白術(shù)藥材的鑒定，為平江白術(shù)的質(zhì)量標準研究及質(zhì)量控制提供理論基礎。