共振瑞利散射法和分光光度法快速測(cè)定3種細(xì)菌懸液的濃度

曹凱欣，邱佩佩，賀錦燦，鄒志輝，白研，毋福海

(廣東藥科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，廣東 廣州 510310)

在藥品、食品等微生物實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌懸液的制備是最基本的工作，快速確定細(xì)菌懸液濃度能提高微生物實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)評(píng)估及結(jié)果分析效率，而且能為細(xì)菌的分離鑒定及細(xì)菌藥敏試驗(yàn)提供更好的數(shù)據(jù)支撐。目前，細(xì)菌懸液濃度的測(cè)定方法主要為比濁法[1-2]和平皿計(jì)數(shù)法[3-4]，但比濁法用到的比濁儀在實(shí)驗(yàn)室中并不普及，標(biāo)準(zhǔn)比濁管的使用不方便，平皿計(jì)數(shù)法的操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度及效率。

共振瑞利散射(resonance Rayleigh scattering，RRS)技術(shù)是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來(lái)的光譜分析技術(shù)[5]，具有快速、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在藥物、生物、環(huán)境等多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域的分析研究中具有重要的應(yīng)用[6-7]。已有研究報(bào)道，金黃色葡萄球菌和大腸埃氏菌能產(chǎn)生相似的RRS信號(hào)[8-9]，RRS法也用于細(xì)菌的間接鑒別[10]，但用RRS法檢測(cè)細(xì)菌懸液濃度鮮見(jiàn)報(bào)道。

分光光度法是通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)在被特定波長(zhǎng)的光照射下的吸收強(qiáng)度，并對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法[11-12]。分光光度法具有儀器簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。細(xì)菌懸液具有一定的濁度，對(duì)光具有一定的吸收，因此可以通過(guò)測(cè)定細(xì)菌懸液在某個(gè)波長(zhǎng)下的吸光度值反映細(xì)菌懸液的濃度[13]。

食源性致病菌是一類(lèi)以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌，也是引起食源性疾病和食物中毒的主要原因。致病菌所引起的食源性疾病暴發(fā)案例占大多數(shù)，是食品安全的重大隱患，建立食源性致病菌的快速分析方法具有重要意義，而食源性致病菌懸液的快速計(jì)數(shù)是提高實(shí)際樣品中細(xì)菌檢測(cè)速度的前提。副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌是3種典型的食源性致病菌，也是《中國(guó)藥典》常見(jiàn)的檢定細(xì)菌。本研究針對(duì)常規(guī)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法的不便，以副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌為例，考察細(xì)菌濃度與RRS值、吸光度值的關(guān)系，建立快速測(cè)定細(xì)菌懸液的RRS法和分光光度法，并對(duì)2種方法的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行比較，為細(xì)菌懸液的實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

LRH-250生化培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；VM-03RU迷你渦旋混勻器(蘇州捷美電子有限公司)；WGZ-XT細(xì)菌濁度儀(杭州齊威儀器有限公司)；F-2500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；U-3010紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本日立公司)；721-100分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)1066111，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)；NaCl(99.5%，廣州化學(xué)試劑廠)；生理鹽水(0.9% NaCl水溶液，使用前滅菌處理)；副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)[ATCC17802]，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[ATCC6538]，沙門(mén)氏菌(Salmonella)[CMCC (B) 50071]，菌種均購(gòu)自廣東省微生物研究所。所有供試菌經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)和選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)后進(jìn)行涂片染色鏡檢，在此基礎(chǔ)上，副溶血性弧菌再結(jié)合耐鹽試驗(yàn)和移種MIU培養(yǎng)基進(jìn)行生化反應(yīng)鑒定，金黃色葡萄球菌通過(guò)血漿凝固酶試驗(yàn)和血平板上形成明顯的β溶血環(huán)進(jìn)行鑒定，沙門(mén)氏菌則通過(guò)克氏雙糖(KIA)復(fù)合試驗(yàn)和A～F群O多價(jià)血清凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

2 方法

2.1 細(xì)菌懸液的制備

不同濁度的細(xì)菌懸液[13]：接種副溶血性弧菌，金黃色葡萄球菌與沙門(mén)氏菌的新鮮培養(yǎng)物至斜面培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基+3% NaCl制得)，于37 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，用生理鹽水將3種細(xì)菌的斜面培養(yǎng)物配成麥?zhǔn)蠞岫葹?.4、0.5、0.6、0.7、0.8的細(xì)菌懸液。

系列濃度的細(xì)菌懸液[13]：將3種細(xì)菌培養(yǎng)物用生理鹽水制成的初始細(xì)菌懸液，用平皿計(jì)數(shù)，并進(jìn)行1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128的倍比稀釋?zhuān)瞥上盗袧舛鹊募?xì)菌懸液。

2.2 RSS法測(cè)定細(xì)菌懸液濃度

以生理鹽水為空白對(duì)照液，依次在F-2500型熒光分光光度計(jì)上以λex=λem的模式進(jìn)行同步掃描，在30 min內(nèi)完成測(cè)定，記錄470 nm處[8]空白試劑的RRS強(qiáng)度I0和細(xì)菌懸液的RRS強(qiáng)度IRRS，并計(jì)算變化量ΔIRRS(ΔIRRS=IRRS-I0)。

2.3 分光光度法測(cè)定細(xì)菌懸液濃度

分別取不同麥?zhǔn)蠞岫燃安煌瑵舛鹊?種細(xì)菌的菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，依次測(cè)定在650 nm波長(zhǎng)處的吸光度[13]。

3 結(jié)果

3.1 RSS法測(cè)定3種細(xì)菌懸液濃度

3.1.1 3種細(xì)菌的共振散射光譜 用生理鹽水將副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的斜面培養(yǎng)物制成初始菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，在F-2500型熒光分光光度計(jì)上以λex=λem的模式同步掃描RRS光譜，結(jié)果見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，3種細(xì)菌懸液均能產(chǎn)生RRS信號(hào)，RRS光譜具有一定的區(qū)別，在470 nm處均產(chǎn)生1個(gè)較強(qiáng)的RRS峰。將副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的懸液放置不同時(shí)間(0、10、20、30、40、50、60 min)，檢測(cè)470 nm處的RRS值隨放置時(shí)間的變化情況，結(jié)果表明：當(dāng)放置時(shí)間在30 min內(nèi)時(shí)，3種細(xì)菌懸液在470 nm處的RRS值變化率(與0 min比較)分別為-6.4%～1.7%、-4.1%～3.1%、-5.8%～2.3%；超過(guò)30 min時(shí)，RRS值顯著下降，下降率超過(guò)15%。因此，制備的細(xì)菌懸液需控制在30 min內(nèi)完成測(cè)定。

70006000500040003000200010000IRRS470nmVibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusSalmonella300400500600λ/nm

圖13種細(xì)菌懸液的RRS譜圖
Figure1RRS spectra of three kinds of bacterial suspension

3.1.2 菌懸液散射值與麥?zhǔn)蠞岫鹊年P(guān)系 取不同麥?zhǔn)蠞岫鹊母比苎曰【?、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，在F-2500型熒光分光光度計(jì)上以λex=λem的模式同步掃描RRS光譜。以麥?zhǔn)蠞岫葹闄M坐標(biāo)，以470 nm處的RRS差值ΔIRRS為縱坐標(biāo)、麥?zhǔn)蠞岫?c)為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，麥?zhǔn)蠞岫仍?.4～0.8范圍時(shí)，3種細(xì)菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫扰c散射值變化量存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程分別為ΔI=1 610c+1 500.6、ΔI=1 684c+1 280.0、ΔI=1 273c+1 443.4，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.990 9、0.990 8、0.984 5；副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌的斜率接近，而沙門(mén)氏菌的斜率略低。

300027002400210018001500ΔIRRS0.30.40.50.60.70.80.9麥?zhǔn)蠞岫萔ibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusVibrioparahaemolyticus

圖23種細(xì)菌懸液的散射值變化量與麥?zhǔn)蠞岫鹊木€(xiàn)性關(guān)系圖

Figure2The linear graph between the variation of scattering value and McGrady turbidity of three kinds of bacterial suspension

3.1.3 細(xì)菌懸液濃度與散射值的關(guān)系 按“2.1”項(xiàng)下的方法配制系列濃度的細(xì)菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，測(cè)定不同稀釋度菌液的RRS光譜，結(jié)果見(jiàn)圖3a、3c、3e所示；再分別記錄470 nm處的RRS值，以細(xì)菌懸液濃度為橫坐標(biāo)、470 nm處的RRS差值ΔIRRS為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見(jiàn)圖3b、3d、3f所示。從圖3可見(jiàn)，副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌的菌懸液濃度(c)分別在0.040×107～1.3×107、0.17×108～5.5×108、0.15×108～4.9×108cfu/mL范圍內(nèi)與470 nm處的散射值變化量(ΔIRRS)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程分別為ΔIRRS=4 655.8c+181.11、ΔIRRS=1 798.6c+370.28、ΔIRRS=1 440.1c+234.92，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.999 8、0.998 7、0.999 4；金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的斜率相近，而副溶血性弧菌的斜率比前兩者大；通過(guò)計(jì)算，檢出限分別為2.6×104、9.5×105、2.1×106cfu/mL。

3.2 分光光度法測(cè)定3種細(xì)菌懸液濃度

3.2.1 3種細(xì)菌懸液的紫外-可見(jiàn)吸收光譜 副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的紫外-可見(jiàn)光譜見(jiàn)圖4所示?？梢?jiàn)，3種細(xì)菌的紫外-可見(jiàn)光譜相似，在紫外區(qū)均具有1個(gè)強(qiáng)吸收峰，而在可見(jiàn)區(qū)無(wú)吸收峰。

3.2.2 3種細(xì)菌懸液吸光度與麥?zhǔn)蠞岫鹊年P(guān)系 取不同麥?zhǔn)蠞岫鹊母比苎曰【⒔瘘S色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，按照《中國(guó)藥典》二部附錄的紫外可見(jiàn)分光光度法，測(cè)定650 nm波長(zhǎng)處吸光度。以麥?zhǔn)蠞岫?c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果顯示：在麥?zhǔn)蠞岫葹?.4～0.8的范圍內(nèi)，3種細(xì)菌懸液的麥?zhǔn)蠞岫扰c吸光度均存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程分別為A=0.423c+0.054、A=0.555c-0.046、A=0.514c+0.001，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.991 5、0.992 0、0.996 5；不同細(xì)菌的回歸方程的斜率有所不同。

3.2.3 細(xì)菌懸液吸光度與濃度的關(guān)系 按“2.1”項(xiàng)下方法配制系列濃度的細(xì)菌懸液，以生理鹽水為空白對(duì)照液，測(cè)定不同稀釋度菌液在650 nm處的吸光度。以細(xì)菌懸液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，擬合線(xiàn)性曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌3種細(xì)菌的菌懸液的濃度分別在0.27×107～8.7×107、0.30×108～9.7×108、0.34×108～11×108cfu/mL范圍內(nèi)與吸光度呈較好的線(xiàn)性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r值分別為0.999 6、0.999 8、0.999 8；金黃色葡萄球菌與沙門(mén)氏菌的斜率相近，副溶血性弧菌的斜率略高；通過(guò)進(jìn)一步計(jì)算，檢出限分別為0.10×106、7.5×106、8.5×106cfu/mL。

61616180006000400020000AB80006000400020000300400500600λ/nm0.30.60.91.21.50細(xì)菌濃度/(?107cfu?mL-1)10000800060004000200001000080006000400020000800060004000200001000080006000400020000D300400500600λ/nm300400500600λ/nm0123450123456CEFIRRSΔIRRS細(xì)菌濃度/(?107cfu?mL-1)細(xì)菌濃度/(?107cfu?mL-1)

A.不同濃度下副溶血性弧菌的RRS譜圖(1～6分別為0.040×107,0.080×107,0.16×107,0.32×107,0.65×107,1.3×107cfu/mL)； B.副溶血性弧菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系圖； C.不同濃度下金黃色葡萄球菌的RRS譜圖(1～6分別為0.17×108,0.34×108,0.68×108,1.4×108,2.7×108,5.5×108cfu/mL)； D.金黃色葡萄球菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系圖； E.不同濃度下沙門(mén)氏菌的RRS譜圖(1～6分別為0.15×108,0.30×108,0.61×108,1.2×108,2.4×108,4.9×108cfu/mL)； F.沙門(mén)氏菌的濃度與RRS譜圖470 nm處強(qiáng)度的線(xiàn)性關(guān)系圖。

圖3不同濃度下3種細(xì)菌懸液的RRS圖及線(xiàn)性關(guān)系圖(470 nm)
Figure3RRS spectra of three kinds of bacterial suspension with different concentrations and the linear relationship (470 nm)

VibrioparahaemolyticusStaphylococcusaureusSalmonella3.52.82.11.40.70.0300400500600700800λ/nmA

圖43種細(xì)菌懸液的紫外吸收光譜圖

Figure4The absorption spectra of three kinds of bacterial suspension

3.3 平皿計(jì)數(shù)法、RRS法和分光光度法測(cè)定細(xì)菌懸液濃度的結(jié)果比較

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，將RRS法和分光光度法(標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法)應(yīng)用于麥?zhǔn)蠞岫葹?.5的細(xì)菌懸液濃度的測(cè)定，并與平皿計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，以平皿計(jì)數(shù)法為參考，RRS法的相對(duì)誤差為-6.3%～9.2%，分光光度法的相對(duì)誤差為-6.7%～7.8%，2種方法的相對(duì)誤差均在±10%以?xún)?nèi)，說(shuō)明RRS法、分光光度法與平皿計(jì)數(shù)法結(jié)果的符合度較高。

表1 分光光度法測(cè)定3種細(xì)菌懸液的方法特性Table 1 The analytical performance of determination of three bacterial suspension by spectrophotometry

表2 3種方法測(cè)定3種細(xì)菌懸液濃度Table 2 Determination of three kinds of bacterial suspension with three different methods (n=3)

4 討論

本文以副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌為例，建立了快速測(cè)定3種細(xì)菌懸液的RRS法和吸光光度法。RRS法測(cè)定細(xì)菌懸液表面攜帶的電荷且存在界面能帶，在470 nm入射光激發(fā)下，一部分細(xì)菌菌體的界面分子吸收光子及發(fā)生能量轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生散射光，從而產(chǎn)生一定強(qiáng)度的RRS信號(hào)[9]。RRS信號(hào)隨著細(xì)菌懸液濃度的增大而增強(qiáng)，在一定范圍內(nèi)兩者間呈現(xiàn)線(xiàn)性相關(guān)性，因此可以通過(guò)測(cè)定特定波長(zhǎng)(如470 nm)處細(xì)菌懸液的散射值確定其濃度。該方法檢出限低，菌懸液在1×104cfu/mL以上即可檢出；但RRS法的測(cè)定結(jié)果受測(cè)定時(shí)間的影響較大，需在30 min內(nèi)測(cè)定完畢。在一定范圍內(nèi)，細(xì)菌懸液的濃度與吸光度值之間存在良好的線(xiàn)性關(guān)系，因此可以通過(guò)測(cè)定的吸光度值確定細(xì)菌懸液濃度，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定，但靈敏度較RRS法低。用分光光度法測(cè)定細(xì)菌懸液濃度時(shí)，菌落總數(shù)宜在105～108cfu/mL之間，否則會(huì)偏離朗伯—比爾定律，導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。此外，細(xì)菌死亡可能導(dǎo)致濁度增加，從而引起吸光度增加[14]，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。為了排除該假陽(yáng)性，在分析前可以先取一部分菌液進(jìn)行美藍(lán)(或剛果紅、中性紅等無(wú)毒染料)染色[15]，分辨細(xì)菌是活菌還是死菌，再進(jìn)行后續(xù)分析。

總之，RRS法和吸光光度法可用于細(xì)菌懸液的快速測(cè)定，為藥品、食品等微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員提供便捷、普適性的檢測(cè)技術(shù)，具有一定的實(shí)用性。