甘草水提后藥渣的化學(xué)成分及抗氧化活性研究

趙森銘，李慧曉，張志超，辛愛玲，馬斌

(1.洛陽市食品藥品檢驗所中藥室，河南 洛陽 471023； 2.洛陽市中心血站檢驗科，河南 洛陽 471000； 3.山東大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，山東 濟南 250100 )

甘草是豆科植物烏拉爾甘草GlycyrrhizauralenssisFish.、脹果甘草GlycyrrhizainflateBat.和光果甘草GlycyrrhizaglabraL.的干燥根和根莖[1]，是常用中藥材。長期以來，醫(yī)藥企業(yè)采用水提、含水醇提、堿提等方法從甘草藥材中僅提取主要藥效成分——甘草酸，提取后的藥渣則直接作為工業(yè)廢料丟棄[2]。每年甘草制劑及其提取物的甘草消耗量巨大，由此產(chǎn)生的藥渣往往直接被填埋，是一種極大的資源浪費。

近幾年來，有學(xué)者將研究目標(biāo)開始轉(zhuǎn)向甘草藥渣，如劉芬等[3]研究表明甘草藥渣具有良好的抗氧化活性，但目前的研究多集中在粗提取物或者少數(shù)幾個黃酮類成分[3-5]。因此，為進一步明確甘草藥渣的化學(xué)成分，進而明確甘草藥渣中的抗氧化活性成分，本文采用與工業(yè)上一致的方式提取的甘草藥渣(即藥材先用水煎煮2次，提取后的藥材即為甘草藥渣)，用體積分數(shù)95%乙醇提取其脂溶性成分，進一步對乙醇提取物進行提取分離，從中分離鑒定得到了10個化合物，并進行抗氧化活性測試。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

甘草于2017年12月購于寧夏，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)李然教授鑒定為豆科植物烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)的干燥根及根莖。ODS-C18 填料(蘇州本草天成生物技術(shù)公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國GE公司)；柱色譜硅膠100～200目、200～300目(青島海洋化工廠)；薄層層析硅膠板(HSGF254，煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司)；其他試劑(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 儀器

Bruker AVANCE III 500核磁共振儀(德國布魯克公司)；QTrap 4500+型質(zhì)譜儀(加拿大AB SCIEX)；Shimadzu LC-20AB高效液相色譜儀、DAD檢測器(日本島津公司)；LC-20AT半制備高效液相色譜儀(美國Kromsil公司250 mm×10 mm，5 μm；制備柱)。

2 提取與分離

甘草藥材(30 kg)，加入8倍量水加熱回流提取2次，每次3 h。藥材殘渣再用體積分數(shù)95%乙醇加熱回流提取2次，每次3 h，過濾合并濾液減壓回收乙醇至無醇味。流浸膏加水懸浮后依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取2次，減壓回收，最終得到乙酸乙酯部位185.73 g。乙酸乙酯部位首先經(jīng)減壓硅膠柱層析(200～300目)，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脫(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50、0∶100)，得到6個洗脫部位，分別為Fr1～Fr6。Fr2(65.72 g)經(jīng)ODS反相中壓柱層析，依次用甲醇-水梯度洗脫得到Fr2.1～Fr2.7；Fr2.2(17.33 g)用Sephadex LH-20凝膠柱色譜(MeOH)和半制備液相色譜分離純化得到化合物1(55 mg)、化合物9(153 mg)、化合物10(306 mg)；Fr2.3(14.29 g)同樣用Sephadex LH-20凝膠柱色譜(MeOH)和半制備液相色譜分離純化得到化合物3(272 mg)、化合物4(37 mg)、化合物7(48 mg)、化合物8(97 mg)；Fr2.4(15.40 g)同樣用Sephadex LH-20凝膠柱色譜(MeOH)和半制備液相色譜分離純化得到化合物2(351 mg)、化合物5(13 mg)、化合物6(26 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色針晶(吡啶)，mp 256～258 ℃，ESI-MSm/z: 269 [M+H]+，分子式C16H12O4(不飽和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：8.29(1H，s，H-2)，7.93(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.90(1H，dd，J=9.5，2.0 Hz，H-6)，6.87(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，3.69(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：152.8(C-2)，124.0(C-3)，174.3(C-4)，116.3(C-5)，114.7(C-6)，162.3(C-7)，101.9(C-8)，158.7(C-9)，127.0(C-10)，122.9(C-1′)，128.8(C-2′)，113.2(C-3′)，157.1(C-4′)，113.3(C-5′)，130.0(C-6′)，54.9(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，故鑒定該化合物為芒柄花素(Formononetin)。

化合物2：淡黃色粉末(吡啶)，mp 180～182 ℃，ESI-MSm/z: 353 [M+H]+，分子式C20H16O6(不飽和度Ω=13)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：12.95(1H，s，5-OH)，11.03(1H，s，7-OH)，8.23(1H，s，H-2)，6.87(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，6.67(1H，d，J=2.0 Hz，H-6′)，6.29(1H，d，J=10.5 Hz，H-4″)，6.23(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.08(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，5.69(1H，d，J=10.5 Hz，H-3″)，1.32(6H，s，H-5″，6″)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：157.4(C-2)，122.6(C-3)，179.4(C-4)，161.7(C-5)，99.4(C-6)，165.7(C-7)，93.9(C-8)，157.4(C-9)，103.6(C-10)，120.0(C-1′)，117.3(C-2′)，144.8(C-3′)，153.6(C-4′)，116.8(C-5′)，139.7(C-6′)，75.7(C-2″)，131.0(C-3″)，121.8(C-4″)，27.4(C-5″)，27.4(C-6″)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定該化合物為半甘草異黃酮B(Semilicoisoflavone B)。

化合物3：白色粉末(吡啶)，mp 265～266 ℃，ESI-MSm/z: 447 [M+H]+，分子式C22H22O10(不飽和度Ω=12)。1H-NMR(C5D5N，500 MHz)δ：13.4(1H，s，5-OH)，8.14(1H，s，H-2)，7.68(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，7.07(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.93(1H，s，H-8)，6.85(1H，s，H-6)，5.78(1H，d，J=7.5 Hz，glc-H-1)，3.71(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(C5D5N，125 MHz)δ：153.9(C-2)，121.0(C-3)，181.0(C-4)，162.8(C-5)，100.5(C-6)，163.4(C-7)，95.0(C-8)，157.8(C-9)，107.1(C-10)，122.6(C-1′)，130.5(C-2′)，114.1(C-3′)，160.0(C-4′)，114.1(C-5′)，130.5(C-6′)，101.5(glc-C-1)，74.5(glc-C-2)，78.1(glc-C-3)，70.9(glc-C-4)，78.9(glc-C-5)，62.1(glc-C-6)，55.1(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定該化合物為5，7-二羥基-4′-甲氧基異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sissotrin)。

化合物4：白色針晶(吡啶)，mp 216～217 ℃，ESI-MSm/z: 431 [M+H]+，分子式C22H22O9(不飽和度Ω=12)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：8.25(1H，s，H-2)，8.07(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，7.30(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.22(1H，dd，J=9.5，2.0 Hz，H-6)，6.98(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，5.10(1H，d，J=4.5 Hz，glc-H-1)3.73(3H，s，4′-OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：153.1(C-2)，124.0(C-3)，174.3(C-4)，126.5(C-5)，115.2(C-6)，161.9(C-7)，103.0(C-8)，157.4(C-9)，118.5(C-10)，123.0(C-1′)，129.7(C-2′)，113.2(C-3′)，159.4(C-4′)，113.2(C-5′)，129.7(C-6′)，101.0(glc-C-1)，73.9(glc-C-2)，77.8(glc-C-3)，70.6(glc-C-4)，77.0(glc-C-5)，61.7(glc-C-6)，54.0(4′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定該化合物為芒柄花苷(Formononetin-7-O-β-D-glucopyranoside)。

化合物5：白色粉末(三氯甲烷)，mp 198～199 ℃，ESI-MSm/z: 425 [M+H]+，分子式C22H16O9(不飽和度Ω=15)。1H-NMR(CDCl3，500 MHz)δ：8.13(1H，s，H-2)，8.01(1H，d，J=9.5 Hz，H-5)，7.45(2H，d，J=10.5 Hz，H-2′，6′)，6.93(1H，dd，J=9.5 Hz，H-6)，6.85(2H，d，J=10.5 Hz，H-3′，5′)，6.73(1H，d，J=10.0 Hz，H-4″)，5.69(1H，d，J=10.0 Hz，H-3″)，1.42(6H，s，H-2″-CH3)。13C-NMR(CDCl3，125 MHz)δ：152.6(C-2)，125.6(C-3)，176.8(C-4)，127.3(C-5)，116.0(C-6)，158.4(C-7)，109.7(C-8)，153.2(C-9)，118.9(C-10)，123.0(C-1′)，130.9(C-2′)，115.7(C-3′)，156.5(C-4′)，115.7(C-5′)，130.9(C-6′)，78.5(C-2″)，131.0(C-3″)，115.8(C-4″)，28.6(C-2″-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為Isoerythrinin A。

化合物6：無色針晶(吡啶)，mp 298～299 ℃，ESI-MSm/z: 271 [M+H]+，分子式C15H10O5(不飽和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：12.89(1H，s，5-OH)，10.85(1H，s，7-OH)，9.53(1H，s，4′-OH)，8.25(1H，s，H-2)，7.38(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.88(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.33(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.15(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：153.5(C-2)，122.0(C-3)，180.0(C-4)，161.7(C-5)，99.5(C-6)，164.1(C-7)，93.4(C-8)，157.1(C-9)，104.4(C-10)，121.4(C-1′)，129.8(C-2′)，115.1(C-3′)，157.3(C-4′)，115.1(C-5′)，129.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定該化合物為染料木素(Genistein)。

化合物9：黃色粉末(吡啶)，mp 291～292 ℃，ESI-MSm/z: 331 [M+H]+，分子式C17H14O7(不飽和度Ω=11)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ: 7.43(2H，s，H-2′，6′)， 7.01(1H，s，H-3)， 6.89(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.76(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，3.88(6H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 164.5(C-2)，104.3(C-3)，182.5(C-4)，162.9(C-5)，99.8(C-6)，165.6(C-7)，94.8(C-8)，158.4(C-9)，104.8(C-10)，121.2(C-1′)，105.2(C-2′,6′)，149.1(C-3′，5′)，141.9(C-4′)，56.4(3′，5′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定化合物為苜蓿素(Tricin)。

化合物10：白色針晶(吡啶)，mp 206～207 ℃，ESI-MSm/z: 257 [M+H]+，分子式C15H12O4(不飽和度Ω=9)。1H-NMR(DMSO-d6，500 MHz)δ：7.70(1H，d，J=9.0 Hz，H-5)，7.48(2H，d，J=9.0 Hz，H-2′，6′)，6.81(2H，d，J=9.0 Hz，H-3′，5′)，6.55(1H，d，J=9.0，2.0 Hz，H-6)，6.41(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，5.50(1H，dd，J=13.0，2.5 Hz，H-2)，3.16(1H，dd，J=16.5，13.0 Hz，H-3α)，2.65(1H，dd，J=16.5，2.5 Hz，H-3β)。13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：79.1(C-2)，43.3(C-3)，190.2(C-4)，128.5(C-5)，110.3(C-6)，165.0(C-7)，102.8(C-8)，163.3(C-9)，113.8(C-10)，129.2(C-1′)，128.5(C-2′,6′)，115.1(C-3′，5′)，158.1(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物為甘草素(Liquiritigenin)。

4 抗氧化活性的測定

采用DPPH法對化合物1～10進行抗氧化活性測定[16]：向96孔板中加入新鮮配制的0.18 mmo1/L DPPH乙醇溶液和以無水乙醇配制的不同濃度梯度的受試液各100 μL，混勻，室溫下避光靜置30 min，測定在517 nm波長下的吸光度(A1)；以無水乙醇為參比溶液，以無水乙醇等量替換受試液為空白對照，測定吸光度(A0)；以樣品溶液與無水乙醇各100 μL的混合溶液為樣品對照，測定吸光度(A2)，用來消除樣品本身顏色所產(chǎn)生的誤差；以維生素C作為陽性對照，平行3次，分別計算清除率。結(jié)果見表1?？梢?，化合物1～8均有較強的清除DPPH自由基的能力，化合物9和化合物10都不具有清除DPPH自由基的能力；組間統(tǒng)計分析可見：化合物2具有較強的抗氧化能力，但弱于維生素C，化合物3和化合物6比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，化合物4、化合物7和化合物8相比也無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 化合物1～10清除DPPH自由基的IC50值

化合物IC50/(μg·mL-1)化合物IC50/(μg·mL-1)165.1±1.2a633.0±2.2c28.9±0.3b761.1±1.7d336.8±1.4c858.0±1.4d459.3±1.6d9158.7±7.9547.2±2.1e10>400維生素C2.1±0.1f

注：不同的字母表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

5 結(jié)論

本文采用工業(yè)提取甘草的方式得到甘草藥渣，從中共分離得到了10個黃酮類化合物，包括異黃酮類6個，查爾酮類2個，黃酮類1個以及二氫黃酮類1個；化合物3～9首次從甘草藥渣中分離得到。采用DPPH法測定所分離得到的10個化合物的抗氧化活性，其中化合物1～8均有較強的抗氧化活性。

工業(yè)上大量生產(chǎn)甘草酸產(chǎn)生了大量的甘草藥渣工業(yè)廢棄物，本文結(jié)果可為甘草藥渣的資源再生利用提供重要依據(jù)。