GNPS指導(dǎo)下瀕危藥材重樓微生物次生代謝產(chǎn)物的研究

汪玉梅，胡金姍，吳愛(ài)芝，盧靜容，范倩，張譯心，榮莉，張翠仙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

重樓為百合科植物云南重樓Parispolyphyllasmith varyunnanensis(Franch.) Hand-Mazz或七葉一枝花Parispolyphyllasmith varchinese(Franch.) Hara的干燥根莖[1-2]，是瀕危中藥材。由于重樓療效顯著，一直被醫(yī)家推崇。重樓性微寒，味苦，有小毒，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效。目前，普遍認(rèn)為重樓的藥效成分為重樓皂苷類成分[3-4]。市場(chǎng)上流通的含有重樓的中成藥產(chǎn)品有云南白藥、芪珍膠囊、肝復(fù)樂(lè)膠囊等，主要用于治療暑濕感冒、惡寒發(fā)熱、頭痛無(wú)汗、腹痛吐瀉、水腫、小便不利[1]。由于市場(chǎng)對(duì)重樓需求旺盛、無(wú)序采挖等，導(dǎo)致重樓野生資源瀕臨枯竭狀態(tài)，市場(chǎng)價(jià)格不斷攀升(目前為1.9元/g)，重樓資源匱乏。針對(duì)以上問(wèn)題，有學(xué)者提出從微生物角度進(jìn)行資源保護(hù)[5]。目前，共有69個(gè)菌屬超過(guò)800種內(nèi)生微生物被研究[6]，但未見(jiàn)關(guān)于重樓皂苷或其直接相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道。

GNPS(Global Natural Products Social Website)是新興的可視化分子網(wǎng)絡(luò)，對(duì)復(fù)雜體系的物質(zhì)基礎(chǔ)給予“可視性”提示[7-9]，廣泛應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)、代謝、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域復(fù)雜體系的分子預(yù)測(cè)。GNPS的特點(diǎn)是可以通過(guò)天然物的二級(jí)質(zhì)譜特征將天然物中具有相似二級(jí)質(zhì)譜的成分聚集在一起，形成分子籠，且不同的母離子構(gòu)建成形狀、尺寸和顏色意味著不同的化合物簇[10]。目前，GNPS已經(jīng)收錄了22 644個(gè)化合物和235 850個(gè)譜圖[9]，可以快捷、可視、簡(jiǎn)便的用于指導(dǎo)天然物的分離，尤其是在結(jié)構(gòu)新穎化合物的發(fā)現(xiàn)中具有明顯優(yōu)勢(shì)。如，黃璐琦等[11]采用分子網(wǎng)絡(luò)對(duì)傳統(tǒng)中藥天麻的化學(xué)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了152個(gè)化合物，其中70個(gè)化合物是新化合物；同時(shí)還對(duì)云南重樓和七葉一枝花的成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，共鑒定146個(gè)成分，新結(jié)構(gòu)42個(gè)[12]。本研究旨在通過(guò)對(duì)重樓內(nèi)生及根際土壤相關(guān)的微生物的研究，建立重樓微生物次生代謝產(chǎn)物的指紋圖譜和GNPS網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，以期找到與宿主重樓相同或相近次生代謝產(chǎn)物的微生物，從而更有效地保護(hù)這一瀕危藥材，為重樓的資源保護(hù)提供新思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SW-CJ-1FD單人單面超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；LX-B75L高壓滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；HYG-A電熱恒溫?fù)u床(太倉(cāng)市試驗(yàn)設(shè)備廠)；AUY120電子分析天平(廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司)；Sartorius賽多利斯十萬(wàn)分之一天平(季爾國(guó)際貿(mào)易有限公司)；XHRE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；SHZ-DⅢ真空水泵(河南鞏義予華儀器有限公司)；XHDLSB-5/25低溫冷卻液循環(huán)泵(上海霄漢實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；AB SCIEX Triple TOFTM 5600+四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(美國(guó)AB SCIEX公司)。

1.2 試劑

乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(分析純，廣州東巨精細(xì)化工有限公司)；甲醇(GR，上海邁瑞爾科技有限公司)；GF254型硅膠(青島海洋化工廠)；AlCl3、H2SO4-EtOH、香草醛濃硫酸、KOH、FeCl3及KBiI4顯色劑(實(shí)驗(yàn)室自制)；TLC硅膠板(自制)。

重樓皂苷Ⅰ(C-036-151122，CAS：50773-41-6)、重樓皂苷Ⅱ(C-037-160623，CAS：76296-72-5)、重樓皂苷Ⅵ(C-038-160126，CAS：55916-51-3)和重樓皂苷Ⅶ(C-039-160623，CAS：76296-75-8)對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)自成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.3 重樓

處于營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期的健康重樓，于2017年12月31日采自貴州六盤(pán)水，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院彭光天博士鑒定為重樓屬百合科云南重樓正品(Parispolyphyllavar.yunnanensis，樣品編號(hào)為RP，保存在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及天然藥物實(shí)驗(yàn)室)。同期采集同根植株的根(樣品編號(hào)為RP-R)、根狀莖(樣品編號(hào)為RP-Rh)、莖(樣品編號(hào)為RP-S)、葉(樣品編號(hào)為RP-L)、根際土壤(樣品編號(hào)為RP-I)，用無(wú)菌袋裝好后送至實(shí)驗(yàn)室，低溫保存?zhèn)溆?。樣品得到? h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生菌及根際土壤相關(guān)的微生物的分離。

1.4 培養(yǎng)基

微生物分離及發(fā)酵用培養(yǎng)基見(jiàn)表1和表2。

表1 微生物分離用培養(yǎng)基成分組成(1 L)Table 1 Composition of medium for the microorganisms isolation (1 L)

表2 微生物發(fā)酵用培養(yǎng)基成分組成(1 L)

Table2Composition of medium for the microorganisms fermentation (1 L)

培養(yǎng)基組成配方PDA葡萄糖(2.0%)、馬鈴薯(200.0 g)、蒸餾水1 000 mL。GPY葡萄糖(1.0%)、酵母膏(0.2%)、蛋白胨(0.1%),蒸餾水1 000 mL。真菌一號(hào)山梨醇(5.0%)、麥芽糖(4.0%)、味精(1.0%)、色氨酸(0.05%)、酵母膏(1.3%)、MgSO4·7H2O(0.03%)、KH2PO4(0.05%),蒸餾水1 000 mL。黃豆黃豆粉100.0 g,蒸餾水200.0 mL。大米大米100.0 g,蒸餾水200.0 mL。

2 方法

2.1 重樓微生物的分離純化

將重樓葉、莖、芽、根、根狀莖按以下流程進(jìn)行表面消毒：無(wú)菌水漂洗3次(1 min/次)→體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡3 min→質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%次氯酸鈉浸泡1 min→無(wú)菌水漂洗3次(1 min/次)[13-14]。最后一次漂洗所得的無(wú)菌水作為空白對(duì)照。消毒好的部位作為內(nèi)生微生物分離備用。

取表皮消毒的重樓部位放入無(wú)菌研缽中研磨，吸取研磨液(原液)100 μL于EP管中，依次用無(wú)菌水分別稀釋10-1和10-3；分別取10-3和10-1稀釋液及原液進(jìn)行平板涂布，每塊平板40 μL。取重樓根際土壤于EP管中溶于無(wú)菌水，用無(wú)菌水稀釋10-1和10-3，取10-3和10-1稀釋液進(jìn)行平板涂布，每塊平板40 μL。不同重樓部位的不同濃度與土壤溶液的不同濃度分別在PDA、A1、CMM和M102培養(yǎng)基上各涂布2塊平板(無(wú)菌水1塊)。每種培養(yǎng)基各做1塊空氣空白平板，密封培養(yǎng)皿，貼好標(biāo)簽后放入28.0 ℃培養(yǎng)箱重靜置培養(yǎng)。待以上固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出菌落后，對(duì)比挑選生長(zhǎng)狀態(tài)不同的菌落，用接種環(huán)將菌落挑起，于與原固體培養(yǎng)基相同的平板上劃線純化(“之”字形)，使菌落逐步稀釋。整個(gè)過(guò)程在超凈工作臺(tái)上完成，密封培養(yǎng)皿，放入28.0 ℃培養(yǎng)箱重靜置培養(yǎng)。觀察菌落生長(zhǎng)狀況。待平板上生長(zhǎng)出單菌落之后，用接種環(huán)將菌落挑起，放入菌種保存管中(須高壓滅菌)，加入40%甘油和原液體培養(yǎng)基體積比為1∶1約1 mL密封保存，-80 ℃冰箱保存菌株，保存菌種待用。

2.2 目標(biāo)菌種的鑒定

將菌種管從冰箱取出解凍后用接種環(huán)蘸取適量的菌液，接種到含有固體培養(yǎng)基的平板上，每種菌分別接種到瓊脂平板培養(yǎng)基上，置恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待平板長(zhǎng)出單菌落后，在顯微鏡下觀察，對(duì)比其生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)，挑選與保存前形態(tài)一致的菌落，采用微生物基因組測(cè)序方法(ITS及D1/D2)進(jìn)行菌種鑒定[15-17]。

2.3 重樓微生物提取液的制備

2.3.1 不同培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng) 根據(jù)菌種鑒定結(jié)果以及對(duì)菌株目前化學(xué)成分研究現(xiàn)狀的文獻(xiàn)總結(jié)，挑選其中具有典型特征的菌株：RP-I-2、RP-I-3、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3和RP-S-4，用接種環(huán)分別挑取目標(biāo)菌株平板上長(zhǎng)出的單菌落接種到裝有50 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，在28 ℃的CO2恒溫培養(yǎng)箱中(165 r/min)培養(yǎng)2～3 d，獲得目標(biāo)菌株的種子培養(yǎng)液。吸取不同種子液(3.0 mL)分別加入不同的液體或固體培養(yǎng)基(1 L發(fā)酵瓶)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基分別發(fā)酵2.0 L。

真菌在28 ℃下靜置培養(yǎng)60 d；細(xì)菌于28 ℃搖床上(165 r/min)培養(yǎng)7 d；分別與空白培養(yǎng)基對(duì)比觀察是否有明顯的菌株生長(zhǎng)，成長(zhǎng)完畢加入甲醇(5 mL)停止發(fā)酵。

2.3.2 微生物次生代謝產(chǎn)物提取

2.3.2.1 細(xì)菌液體培養(yǎng)物 發(fā)酵完畢的細(xì)菌經(jīng)離心得到菌體和菌液。菌液濃縮至200 mL，依次經(jīng)等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有機(jī)相減壓濃縮得EtOAc-1相和n-BuOH-1相。菌體經(jīng)甲醇重復(fù)浸泡(24 h/次、共3～5次)，甲醇液減壓濃縮得甲醇提取物，水捏溶至200 mL，依次經(jīng)等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有機(jī)相減壓濃縮得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。4株細(xì)菌共得到10個(gè)EtOAc提取物和9個(gè)n-BuOH提取物(見(jiàn)表3)，備用。

表3 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)不同菌種得到的提取物的質(zhì)量

Table3Weight of different extracts of 7 strains from different mediam/mg

培養(yǎng)基RP-I-4(真菌)ABRP-I-2(真菌)ABRP-I-3(真菌)ABRP-L-1ABRP-L-2ABRP-L-3ABRP-S-4ABPDAC598.5150.136.0191.21 312.21 797.051.9435.320.6181.4165.0383.172.9112.4D331.3888.1189.4295.01 337.1235.6769.882.8918.086.31 357.4220.9GPYC397.0339.6315.1385.8243.6250.624.4167.8D694.0460.9143.81 005.4484.0182.722.9249.8真菌一號(hào)C324.9408.7475.0753.7188.5144.0D979.0716.8702.1175.1769.2黃豆2 495.13 089.03 683.4350.5大米19 493.012 540.2897.2

注：A代表EtOAc； B代表n-BuOH； C代表菌(絲)體； D代表菌液。

2.3.2.2 真菌液體培養(yǎng)物 發(fā)酵完畢后經(jīng)甲醇滅活后的發(fā)酵物經(jīng)紗布過(guò)濾得到菌絲體和菌液。菌液濃縮至200 mL，依次經(jīng)等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有機(jī)相減壓濃縮得EtOAc-1相和n-BuOH-1相；菌絲體經(jīng)甲醇重復(fù)浸泡(24 h/次、共3～5次)，甲醇液減壓濃縮得甲醇提取物，將提取物加水混懸至水溶液狀態(tài)(200 mL)，依次經(jīng)等體積的乙酸乙酯(EtOAc)、正丁醇(n-BuOH)萃取，有機(jī)相減壓濃縮得EtOAc-2相和n-BuOH-2相。3株真菌共得到18個(gè)EtOAc提取物和18個(gè)正丁醇提取物(見(jiàn)表3)，備用。

2.3.2.3 黃豆、大米培養(yǎng)基培養(yǎng)物 將發(fā)酵完畢后的固體培養(yǎng)基用乙酸乙酯[(500 mL/(瓶·次)]振搖提取3次，乙酸乙酯提取液減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏。共得到7個(gè)EtOAc提取物(見(jiàn)表3)，備用。

2.4 重樓微生物次生代謝產(chǎn)物指紋圖譜研究

2.4.1 供試品溶液的制備 將表3中得到的提取物分別精密稱取適量，置于1 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成終質(zhì)量濃度為0.10 g/mL的供試品溶液，備用。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ對(duì)照品適量，置于1 mL容量瓶中，加入甲醇溶解定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.4.3 TLC指紋圖譜的建立[13，18]分別用0.5 μL的點(diǎn)樣管吸取“2.4.1”項(xiàng)中的EtOAc相和n-BuOH相樣品，點(diǎn)于不同硅膠薄層板上，分別選取最優(yōu)展開(kāi)體系PE-EtOAc(體積比2∶1)、PE-CH3OH(體積比9∶2)進(jìn)行展開(kāi)，取出，晾干。觀察條件分別為：EtOAc相，自然光、紫外燈(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(顯色后置自然光和紫外燈365 nm下檢視)、香草醛濃硫酸和KOH顯色劑；n-BuOH相，自然光、紫外燈(254 nm和365 nm)、H2SO4-EtOH(顯色后置自然光、紫外燈254 nm和365 nm下檢視)。

2.4.4 LC-MS指紋圖譜的建立[9,13,19]

2.4.4.1 樣品 取“2.4.1”項(xiàng)下正丁醇及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下樣品200 μL用于LC-MS測(cè)試用。

2.4.4.2 UPLC條件 流動(dòng)相為ACN-H2O(0～5 min，10%～30%ACN；5～23 min，30%～90%ACN；23～28 min，100%ACN)；流速為0.7 mL/min；進(jìn)樣量為3 μL；柱溫為30 ℃；色譜柱為Phenomenex(5 mm，4.6 mm×100 mm)。將配制好的樣品于Triple TOF TM5600+質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。

2.4.4.3 MS條件 離子噴霧電壓：4 500 V；離子源溫度：550 ℃；碰撞能量：45 eV；擴(kuò)散碰撞能量：15 eV；去簇電壓：100 V；霧化器壓力：379 kPa；輔助氣壓力：379 kPa；氣簾氣壓力：241 kPa；飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)分子量掃描范圍：100～2 000。

2.4.5 GNPS分子網(wǎng)絡(luò)建設(shè)及數(shù)據(jù)處理 將“2.4.4”項(xiàng)下的正丁醇相及固體培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下菌株次生代謝產(chǎn)物中選取28個(gè)樣品的二級(jí)質(zhì)譜文件通過(guò)MSConvert軟件轉(zhuǎn)換后利用FileZilla FTP Client連接器導(dǎo)入GNPS分子網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(http://gnps.ucsd.edu)，分別建立分子網(wǎng)絡(luò)圖譜，并與混合對(duì)照品和譜庫(kù)中的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配；數(shù)據(jù)分析在Cytoscape軟件中進(jìn)行。

3 結(jié)果與分析

3.1 重樓微生物的分離與鑒定

本文從重樓中共分離得到32株微生物，結(jié)果見(jiàn)表4。

3.2 重樓微生物菌種鑒定

對(duì)菌株的菌(絲)體顏色、形狀等進(jìn)行觀察，選擇其中比較有特色的14株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果顯示：RP-S-1和RP-S-6為假單胞菌屬(Pseudomonas，種未鑒定)，RP-S-3、RP-L-2和RP-L-3均為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，種未鑒定)，RP-I-2、RP-I-3和RP-I-4均為籃狀菌屬(Talaromyces，種未鑒定)，RP-S-2為紅酵母屬Rhodotorulasp.，RP-S-4為芽孢桿菌屬Bacillussp.，RP-S-5為細(xì)桿菌屬M(fèi)icrobacteriumsp.，RP-L-1為寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonassp.，RP-L-4為貪噬菌屬Variovoraxsp.，RP-I-1為Saitozymasp.。genbank提交序列號(hào)為：SUB5958782 RP-I-1，MN176340；SUB5958782 RP-I-2，MN176341；SUB5958782 RP-I-3，MN176342；SUB5958782 RP-I-4，MN176343；SUB5958782 RP-S-2，MN176344；SUB5958805 RP-L-1，MN177117；SUB5958805 RP-L-2，MN177118；SUB5958805 RP-L-3，MN177119；SUB5958805 RP-L-4，MN177120；SUB5958805 RP-S-1，MN177121；SUB5958805 RP-S-3，MN177122；SUB5958805 RP-S-4，MN177123；SUB5958805 RP-S-5，MN177124；SUB5958805 RP-S-6，MN177125。

3.3 重樓微生物代謝產(chǎn)物分析

3.3.1 不同菌株次生代謝產(chǎn)物的TLC指紋圖譜 在不同培養(yǎng)基、不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4進(jìn)行小規(guī)模發(fā)酵，得到各菌株的乙酸乙酯相TLC指紋圖譜見(jiàn)圖1，正丁醇相TLC指紋圖譜見(jiàn)圖2。從圖可見(jiàn)：重樓相關(guān)微生物的次生代謝產(chǎn)物顯色豐富；硫酸乙醇顯色效果較明顯，未顯色時(shí)365 nm下的藍(lán)綠色斑點(diǎn)顯色后為鮮綠色，日光下有黃色及紫色斑點(diǎn)，365 nm下為黃色及粉紅色，推測(cè)可能存在皂苷及酚酸類化合物；香草醛濃硫酸顯色效果亦較明顯，有藍(lán)紫色、藍(lán)綠色、黃色及黑色斑點(diǎn)，可能存在甾體及苯丙素類化合物；KOH顯色后，原來(lái)的橙紅色斑點(diǎn)變?yōu)樽仙?紫紅色，可能存在蒽醌類化合物。

表4 重樓不同部位的微生物種類及數(shù)量Table 4 Microbial species and quantities obtained from different parts of Paris polyphylla

365nm254nm自然光觀察365nm自然光乙酸乙酯顯色觀察香草醛濃硫酸顯色觀察現(xiàn)象現(xiàn)象KOH顯色現(xiàn)象

注：展開(kāi)條件為PE-EtOAc(體積比2∶1)，菌株次生代謝產(chǎn)物點(diǎn)樣順序?yàn)镽P-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4 [RP-I-3、RP-I-2、RP-I-4、RP-L-1中點(diǎn)樣順序?yàn)镻DA(菌絲體、菌液、空白)、GPY(菌絲體、菌液、空白)、真菌一號(hào)(菌絲體、菌液、空白)、大米(EtOAc，空白)、黃豆(EtOAc，空白，PE，空白)；RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4點(diǎn)樣順序?yàn)镻DA(菌絲體、菌液、空白)]。

圖1 7種菌株次生代謝產(chǎn)物的乙酸乙酯相TLC指紋圖譜Figure 1 TLC fingerprints of Ethyl acetate phase of secondary metabolites of 7 strains

注：展開(kāi)條件為PE-CH3OH(體積比9∶2)，菌株次生代謝產(chǎn)物點(diǎn)樣順序?yàn)镽P-I-2、RP-I-4、RP-I-3、RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4[RP-I-2、RP-I-4、RP-I-3中點(diǎn)樣順序?yàn)榫z體(真菌一號(hào)、PDA、GPY)、RP-I-2菌液(真菌一號(hào)、PDA、GPY)、黃豆；RP-L-1、RP-L-2、RP-L-3、RP-S-4中點(diǎn)樣順序?yàn)榫z體(PDA)、菌液(PDA)]。

圖27種菌株次生代謝產(chǎn)物的正丁醇相TLC指紋圖譜
Figure2TLC fingerprints ofN-butanol phase of secondary metabolites of 7 strains

3.3.2 重樓微生物次生代謝產(chǎn)物GNPS分析 GNPS分子網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)的分子之間形成分子籠，這些化合物分子籠可能代表著同一類型化合物，而不同分子籠間的連接關(guān)系可能代表著2個(gè)類型化合物之間存在關(guān)聯(lián)。通過(guò)分子籠特征，分子網(wǎng)絡(luò)能夠快速找到與之關(guān)聯(lián)的相似物或者新化合物，為追蹤和預(yù)測(cè)某類成分提供有利指導(dǎo)[9-12]。以重樓活性物質(zhì)為參照，通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜構(gòu)建的不同菌株的GNPS分子網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖3～圖4)，及實(shí)驗(yàn)室已建立的重樓化學(xué)成分庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)并確定重樓微生物次生代謝產(chǎn)物與宿主有15個(gè)成分相同(見(jiàn)表5)，結(jié)構(gòu)類型涉及螺甾烷醇類、偏諾皂苷元類、苯丙素類、黃酮類、蒽醌類及甾體皂苷等化合物。其中，來(lái)源于重樓根際土壤的微生物次生代謝產(chǎn)物中所含此類成分最多，來(lái)源于重樓葉的內(nèi)生菌中可能含有苷類、苯丙素類及黃酮類化合物，來(lái)源于重樓莖的內(nèi)生菌中可能含有偏諾皂苷元，此結(jié)論與TLC分析可能含有皂苷類、甾體類、苯丙素類和蒽醌類化合物一致，推測(cè)重樓菌株發(fā)酵液中有與重樓主要化學(xué)成分相同的化學(xué)成分。同時(shí)，在對(duì)目標(biāo)菌株的GNPS分子網(wǎng)絡(luò)分析中，RP-I-2菌及RP-I-4菌存在與宿主重樓相同的活性成分flazin(分子式為C17H12N2O4)，這與前面的TLC以及LC-MS的分析結(jié)果一致，該菌值得后續(xù)重點(diǎn)研究。

CLZG-hunbiaoRP-L-1-GPY-B-n-BuOHRP-L-1-GPY-S-n-BuOHRP-L-1-GPDA-B-n-BuOHRP-L-1-PDA-S-n-BuOHRP-L-2-PDA-B-n-BuOHRP-L-2-PDA-S-n-BuOHRP-L-3-PDA-B-n-BuOHRP-L-3-PDA-S-n-BuOHRP-L-4-PDA-B-n-BuOHRP-L-4-PDA-S-n-BuOHCLZG-hunbiaoRP-1-2-been-n-BuOHRP-1-2-GPY-B-n-BuOHRP-1-2-GPY-S-n-BuOHRP-1-2-PDA-B-n-BuOHRP-1-2-PDA-S-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-2-zhenl-B-n-BuOHRP-1-3-been-n-BuOHRP-1-3-GPY-S-n-BuOHRP-1-3-PDA-S-n-BuOHRP-1-3-zhenl-S-n-BuOHRP-1-4-been-n-BuOHRP-1-4-GPY-S-n-BuOHRP-1-4-PDA-B-n-BuOHRP-1-4-PDA-S-n-BuOHRP-1-4-zhenl-S-n-BuOH

圖37種菌株的GNPS網(wǎng)絡(luò)圖(Node中不同顏色代表不同培養(yǎng)基，節(jié)點(diǎn)之間連線代表2個(gè)化合物MS/MS圖譜之間的相關(guān)性)

Figure3GNPS network diagrams of 7 strains (different colors in Node represent different media,and connections between nodes represent the correlation between MS/MS profiles of two compounds)

1a1b3a3b2457a7b68a8b9b109a111213b1413a15

圖4重樓微生物次生代謝產(chǎn)物與宿主化學(xué)成分匹配分子籠放大圖

Figure4Molecular cage enlargement of the matching of microbial secondary metabolites and host chemical components inParispolyphylla

表5 GNPS分析重樓次生代謝產(chǎn)物與宿主匹配的化學(xué)成分信息Table 5 Chemical composition information for GNPS analysis of secondary metabolites matching host Paris polyphylla

4 討論

從藥用植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物中尋找與宿主相同或相近的化學(xué)物質(zhì)，以解決藥用植物資源稀缺的問(wèn)題，是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。瀕危藥材重樓的主要藥用成分是甾體皂苷[3-4]。趙江林等[20]從華重樓(《中國(guó)藥典》收載的2種重樓基源植物之一)中分離得到2株細(xì)菌，并在TLC檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液與重樓總皂苷的層析帶遷移率相當(dāng)，但由于TLC方法的局限性，在沒(méi)有其他分析手段的輔助下不能嚴(yán)格證實(shí)皂苷類成分的存在。本文從藥材重樓不同部位中共分離出20株內(nèi)生菌，從其根際土壤中分離出12株根際相關(guān)的微生物，對(duì)其中的7株在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了TLC、LC-MS分析，并根據(jù)GNPS網(wǎng)絡(luò)分子籠的特點(diǎn)，通過(guò)與已知宿主重樓的化學(xué)成分進(jìn)行LC-MS分析，得出15個(gè)與宿主相同或相似的化學(xué)成分，結(jié)構(gòu)類型涉及螺甾烷醇類、偏諾皂苷元類、苯丙素類、黃酮類、蒽醌類及甾體皂苷等化學(xué)物質(zhì)。其中，來(lái)源于重樓根際土壤的微生物次生代謝產(chǎn)物中所含此類成分最多，可能含有甾體及其苷類、生物堿類、蒽醌類、脂肪酸酯、苯丙素類、黃酮苷類化合物及寡糖，來(lái)源于重樓葉的內(nèi)生菌中可能含有甾體及其苷類、苯丙素類及黃酮苷類化合物，來(lái)源于重樓莖的內(nèi)生菌中可能含有偏諾皂苷元，這對(duì)進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)重樓內(nèi)生及根際相關(guān)的微生物次生代謝產(chǎn)物具有重要意義，同時(shí)也為重樓的資源保護(hù)提供參考依據(jù)。