尚小紅/嚴(yán)華兵/曹 升/肖 亮 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,廣西 南寧 530007

尚小紅/王 艷/歐昆鵬 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,廣西 南寧 530007

晉 玲 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000

葛根(Pueraria DC.)為豆科多年生植物,是國家衛(wèi)生部首批公布的藥食同源植物,享有“北參南葛”、“亞洲人參”的美譽[1]。 葛根含有葛根素、黃酮、多糖等多種藥用成分,具有生津止渴、解表退熱、止瀉等功效[2],且具有維護(hù)心血管系統(tǒng)、抗癌、降血糖等多種藥理活性[3]。 此外,葛根還富含淀粉,可作為非糧生物質(zhì)新能源,具有巨大的開發(fā)潛力。 葛根是廣西傳統(tǒng)種植的農(nóng)作物,種質(zhì)資源豐富且具有一定的種植規(guī)模。其中,廣西梧州市藤縣和平鎮(zhèn)是中國著名的“葛根之鄉(xiāng)”,目前葛根種植面積占全國的20%,是當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的主要經(jīng)濟(jì)收入來源和增收渠道[4-5]。 同時,廣西野生葛根資源在各市縣均有廣泛分布,但因過度采挖導(dǎo)致流失嚴(yán)重。 因此,開展廣西葛根種質(zhì)資源收集、遺傳多樣性評價及利用,對于推動葛根產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

目前,葛根種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析大多采用田間形態(tài)指標(biāo),如葉形、葉長、葉寬、葉花紋、葉面皺紋、葉柄色、葉柄粗、節(jié)間長、莖長、莖粗、分枝數(shù)、莖皮色、塊根形狀等進(jìn)行鑒定評價[6-8],但其易受到環(huán)境、主觀判斷等因素的影響,導(dǎo)致鑒定評價結(jié)果并不準(zhǔn)確,而分子標(biāo)記鑒定具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點。近年來,隨機擴增多態(tài) 性( random amplified polymorphic, RAPD )標(biāo)記[9-11]、內(nèi) 部 簡單 重 復(fù) 序 列 ( inter-simple sequence repeat, ISSR)標(biāo) 記[12-13]、 相 關(guān) 序 列 擴 增 多 態(tài) 性 (sequencerelated amplified polymorphism, SRAP ) 標(biāo)記[14]等技術(shù)已應(yīng)用于葛根遺傳多樣性方面的研究,但目前尚未有針對廣西地方品種的相關(guān)報道。

目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記(start condon targetedpolymorphism,SCoT)是首先在水稻上提出的,是以植物基因中的 ATG 翻譯起始位點側(cè)翼序列的保守性設(shè)計單引物并對基因組進(jìn)行擴增,擴增產(chǎn)物用簡單的瓊脂糖分離檢測的目標(biāo)分子標(biāo)記新技術(shù)[15]。 SCoT 分子標(biāo)記具有操作簡單、通用性強、成本低廉、多態(tài)性豐富等優(yōu)點[16],目前已廣泛應(yīng)用在桃兒七[17]、葡萄[18]、芒果[19]、土豆[20]、枸杞[21]、龍眼[22] 、菠蘿[23]、蘭[24]、柑橘[25]、柳枝稷[26]、鐵皮石斛[27]、菊花[28-29]、南瓜[30]、木薯[31]等多種作物的遺傳多樣性分析、差異表達(dá)基因篩選[32-34]等分子生物學(xué)研究中,但在葛根遺傳多樣性分析上尚無相關(guān)研究報道。 本研究收集了分布于廣西各地的葛根共 44 份種質(zhì)資源,應(yīng)用 SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行遺傳多樣性及親緣關(guān)系的分析,以期為廣西葛根種質(zhì)資源的鑒定評價、利用及進(jìn)一步加快廣西葛根品種改良及選育提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

表 1 供試葛根材料及來源Table 1 Tested Pueraria materials and their origins

本研究所用的試驗材料共計 44 份葛根種質(zhì)資源(詳見表1),收集自廣西河池、百色、桂林、賀州、玉林、梧州、來賓、南寧、防城港和柳州等地,包括5個栽培品種和39個野生品種,種植于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院里建科學(xué)研究基地及廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所育種基地。SCoT引物參照文獻(xiàn)[15],由上海生工生物工程股份有限公司合成(表 2)。 植物基因組 DNA提取試劑盒、DL M2000、瓊脂糖、核酸染料 GelRed、ExTaq DNA聚合酶、50×TAE buffer 等均購自寶生物工程(大連)有限公司。

表2 25條 SCoT 引物的擴增結(jié)果及多態(tài)性信息Table 2 Amplification results and polymorphism information of 25 SCoT primes

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組 DNA 的提取與檢測于 2017 年5 月采集每份葛根種質(zhì)資源的 3～5 個無病蟲害單株生長頂端的幼嫩葉片,置于寫好編號的自封袋后放置于冰盒,帶回廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點開放實驗室,-40℃保存?zhèn)溆谩?混合葉片并用液氮研磨成粉末后,按照植物基因組 DNA提取試劑盒(TaKaRa,日本)說明書提取各材料的基因組DNA。 用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度及完整性,并用UV-2700紫外分光光度計(日本島津)檢測其濃度,稀釋成終濃度為50ng●μL-1,-40℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選從供試材料中選取 4 份形態(tài)學(xué)差異較大的樣品DNA,對36條SCoT 引物進(jìn)行篩選,最終確定穩(wěn)定性、多態(tài)性好且?guī)颓逦?25條引物用于所 DNA 擴增。

1.2.3 SCoT-PCR擴增與檢測 葛根 SCoTPCR擴增體系為20μL,包括 DNA 50ng,dNTPs 0. 25 mmol●L-1,Mg2+1. 5 mmol●L-1,引物 0. 8 μmol●L-1,Taq DNA 聚合酶 0. 5 U,ddH 2 O 補足至 20 μL。 擴增程序 :94℃ 預(yù)變性 4 min;94℃變性 30 s,50℃退火 1 min,72℃延伸 90s,35 個循環(huán);72℃ 終延伸 5 min,4℃ 保存。 反應(yīng)結(jié)束后,取6μL PCR 產(chǎn)物 ,與 1μL 6×Loading buffer 混勻后用含有 GelRed 核酸染色劑的 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離,緩沖液為 1×TAE,在 110 Ⅴ恒電壓下電泳約25 min。 電泳結(jié)束后利用紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析根據(jù)44份葛根種質(zhì)資源SCoT-PCR 擴增產(chǎn)物的電泳圖,按同一分子量大小的DNA 條帶的有無進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計,有條帶記為“1”,無條帶記為“0”,構(gòu)建 44 份材料的分子標(biāo)記結(jié)果的數(shù)據(jù)矩陣。 利用 NTSYS-pc2. 10e 軟件計算遺傳相似系數(shù),并進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT標(biāo)記的多態(tài)性分析

利用 25 條 SCoT 引物對 44 份葛根種質(zhì)資源的DNA 進(jìn)行 PCR 擴增,產(chǎn)物分布在 200～3000 bp 之間,共擴增出 223 條清晰的條帶,每條引物擴增出的條帶數(shù)在 3～15 之間,平均每條引物能擴增出 8. 92 條。 多態(tài)性條帶合計 194 條,平均每條引物擴增出 7. 76 條差異性條帶,多態(tài)性比率高達(dá)86. 99%。 其 中 ,SC2、SC4、SC5、SC12、SC13和 SC21 這 6 條引物擴增出的多態(tài)性條帶比率達(dá)到100%,引物 SC35 擴增產(chǎn)物的多態(tài)性比率最低,為50%(表 2)。 擴增結(jié)果表明,利用 SCoT 標(biāo)記對葛根種質(zhì)資源進(jìn)行擴增,產(chǎn)物表現(xiàn)出條帶豐富、背景清晰干凈、重復(fù)性好且多態(tài)性高的特點(圖 1)。

2.2 相似性分析

圖1 引物 SC22 的 SCoT-PCR 擴增結(jié)果Fig.1 SCoT-PCR amplification by primer SC22

將 25 個引物對 44 份葛根材料擴增的條帶對應(yīng)的原始數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入 NTSYS-pc2. 10e 軟件中,計算出各材料之間的遺傳相似系數(shù),所有葛根供試材料之間的遺傳相似系數(shù)范圍在 0. 587～0. 982之間。 25 號與 26號材料的相似系數(shù)最高,為 0.982,二者與 24 號材料的相似系數(shù)均為 0. 973,三者均為來自廣西百色老山的材料;其次為 28 號與29 號材料,二者的相似系數(shù)高達(dá) 0. 973,二者與 27號材料的相似系數(shù)均為 0. 946,三者均為來自桂林會仙的材料,同時,27 號材料與來自桂林平樂的 30號材料相似系數(shù)高達(dá) 0. 955;來自廣西百色田林的7 號與 8 號材料,相似系數(shù)為 0. 951;來自梧州藤縣的 10 號材料與來自桂林陽朔的 11 號材料,相似系數(shù)為 0. 946。 14 號與 37 號材料的遺傳相似系數(shù)最低,僅為 0. 587,表明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn);37號與4 號材料的遺傳相似系數(shù)為 0. 601;37 號與 12號材料的遺傳相似系數(shù)為 0. 605。

2.3 聚類分析

由圖 2 可知,在遺傳相似系數(shù)為 0. 65 水平時,可將 44 份葛根材料分為兩大類,第一類只包含一個材料,即 37 號材料,其他 43 份材料歸為一類。在遺傳相似系數(shù)為 0. 74 水平時,可將第二大類的43 份葛根材料分為 5 個亞組,其中,第Ⅰ亞組包含了 32 份材料,占所有種質(zhì)資源的 72. 7%;第Ⅱ亞組包含 2 號、4 號、20號、6 號和 9 號共 5 份材料;第Ⅲ亞組包含 35 號、36 號和 39 號共 3 份材料;第Ⅳ亞組包括 21 號和 22 號共 2份材料;第Ⅴ組只有 14 號 1 份材料。 綜上,通過 SCoT標(biāo)記技術(shù)可以將 44 份廣西葛根種質(zhì)資源完全區(qū)分。

3 討論

種質(zhì)資源是進(jìn)行品種選育的材料基礎(chǔ),遺傳多樣性的高低決定了物種的基因豐富程度。 分子標(biāo)記技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地對種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析 [21] 。SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)為通用型引物,適用于各種作物,如多態(tài)性條帶比率在葡萄中高達(dá) 93. 1% [18] ,在菊科作物中高達(dá) 90. 43% [27],在柳枝稷中達(dá)到 90. 3% [26] ,多態(tài)性條帶比率在柑橘中最低,為 54. 8% [25] 。 周精華等 [11] 利用 RAPD 技術(shù)對來自湖南和江西的 8 份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行親緣關(guān)系分析,平均多態(tài)性比率為65.65%;景戌等 [9] 利用 RAPD 標(biāo)記對 12 份重慶地區(qū)的葛根進(jìn)行了遺傳多樣性分析,平均多態(tài)性比率為64. 41%;郭艷艷等 [12] 利用 ISSR 標(biāo)記對來自廣西、云南、江西和湖北 4 個地區(qū)的 11 份葛根種質(zhì)資源進(jìn)行了多態(tài)性及聚類分析,平均多態(tài)性比率為 63. 9%;陳大霞等 [14] 利用 SRAP 標(biāo)記對 18 個粉葛栽培種進(jìn)行遺傳多樣性分析,平均多態(tài)性比率為 63. 9%。 本研究采用 25 條 SCoT 引物對 44 份廣西葛根種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析,檢測出了豐富的差異條帶,平均多態(tài)性比率高達(dá) 86. 99%。本研究采用 SCoT 技術(shù)所獲得的多態(tài)性比率高于利用 RAPD、ISSR 和 SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行檢測的結(jié)果,說明 SCoT 標(biāo)記對葛根種質(zhì)資源具有較高的鑒別能力,可進(jìn)一步應(yīng)用于葛根遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究。

本研究中 44 份供試葛根材料來自廣西不同區(qū)域,SCoT 聚類結(jié)果表明,葛根種質(zhì)資源的親緣關(guān)系與其來源地具有一定的相關(guān)性,但并不完全相關(guān)。 如來自河池的 1 號與 3 號材料,來自百色田林的 7 號與 8 號材料,來自百色老山的 24 號、25號和 26 號材料,來自桂林會仙的 27 號、28 號、29號和 30 號材料,分別聚類在一起。 但來自同一地域的材料,如來自河池的 1 號、36號和 37 號材料,來自桂林的 4 號和 16 號材料,均未聚類在一起,而來自不同地域的材料,如梧州藤縣的 10號材料和桂林陽朔的 11 號材料相似度較高,反而聚類在一起,表明廣西葛根材料具有一定的豐富度,但不同地域的葛根材料可能存在相互引進(jìn)及交流的現(xiàn)象。 這與前人研究結(jié)果 [12,14] 一致。 本研究中,5份栽培葛根材料(10 號、13 號、18 號、38 號和40 號)全部聚類到第一大類的第Ⅰ亞組,其遺傳相似系數(shù)介于 0. 74 ～0. 89 之間,可能是由于長期馴化和定向選擇導(dǎo)致其遺傳背景較為接近。 同時還發(fā)現(xiàn)栽培葛根與野生葛根資源聚類相互交叉,這與袁燦等 [13] 的研究結(jié)果一致。 其中,栽培種 10號、13 號、18 號和 40 號材料分別與野生種 11號、12 號、27 號和 41 號材料的遺傳相似系數(shù)均達(dá)到 0. 90 以上,其原因可能是因為栽培葛根是從這些野生葛根資源的優(yōu)良材料中選育而成。 37 號材料單獨聚到一類,與其他種質(zhì)資源均有較大的遺傳差異,田間表型鑒定發(fā)現(xiàn)該種質(zhì)資源的葉片為墨綠色,且完全無毛,與其他種質(zhì)資源的差異性較大,可進(jìn)一步通過表型鑒定挖掘其在其他方面的特性,開發(fā)與葛根相關(guān)性狀關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記等。 此外,廣西葛根種質(zhì)間遺傳相似度較高,大部分均達(dá)到 0.72 以上,說明其遺傳基礎(chǔ)較為狹窄,需要進(jìn)一步加大種質(zhì)資源引種力度,廣泛引進(jìn)區(qū)內(nèi)外葛根種質(zhì)資源及創(chuàng)制新種質(zhì),豐富種質(zhì)資源的多樣性,為培育優(yōu)良葛根品種奠定基礎(chǔ)。

圖2 44份葛根材料的 SCoT 分子聚類圖Fig.2 Dendrogram of 44 Pueraria accessions by SCoT molecular markers

4 結(jié)論

本研究利用 25 條 SCoT 引物對 44 份廣西葛根材料的基因組 DNA 進(jìn)行 PCR 擴增,平均每條引物獲得7. 76 個多態(tài)性條帶,多態(tài)性比例為 86.99%。 聚類分析結(jié)果表明,44 份葛根種質(zhì)資源的遺傳相似系數(shù)介于0. 587～0. 982 之間。 在系數(shù)為 0.65 處,44 份葛根分為兩大類,37 號材料單獨成為一類;在系數(shù)為 0. 74處,可聚為六類,表明 SCoT分子標(biāo)記適用于葛根種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。本研究結(jié)果為廣西葛根種質(zhì)資源鑒定評價和新品種選育奠定了一定的理論基礎(chǔ)。