外源NO對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿生長(zhǎng)及膜脂過(guò)氧化的影響

蔣文博，陳 釗，曹新龍，牛軍鵬，郭志鵬，崔 健，王佺珍

（1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2. 西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

土壤鹽漬化是人類面臨的世界性問(wèn)題，而鹽漬化土地也是我國(guó)重要的、具有潛在利用價(jià)值的邊際土地資源。我國(guó)鹽堿化土地總面積約為3 667萬(wàn)hm2，其中鹽漬化耕地近670萬(wàn)hm2，約占全國(guó)耕地面積的5%[1-3]。鹽脅迫是植物生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成的重要限制因素之一，鹽脅迫不僅會(huì)引起植物失水，還會(huì)造成離子毒害，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)失衡。在正常條件下，植物體內(nèi)的離子能夠保持動(dòng)態(tài)平衡，而在鹽脅迫下，Na+濃度過(guò)高會(huì)引起植物發(fā)生缺素現(xiàn)象，進(jìn)而影響植物的營(yíng)養(yǎng)吸收和生長(zhǎng)[4]。Cheruth等[5]指出鹽生環(huán)境可通過(guò)對(duì)植物體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸及物質(zhì)代謝途徑進(jìn)行調(diào)控，從而達(dá)成對(duì)植物生長(zhǎng)的抑制。

紫花苜蓿(Medicago sativa)是優(yōu)質(zhì)的多年生豆科牧草，多在我國(guó)干旱、半干旱地區(qū)種植，這些地區(qū)同樣是我國(guó)土地鹽漬化的多發(fā)區(qū)域。土地鹽堿化嚴(yán)重影響著紫花苜蓿的生長(zhǎng)、發(fā)育以及質(zhì)量和產(chǎn)量。龍明秀等[6]研究證明當(dāng)鹽濃度超過(guò)40 mmol·L-1后，紫花苜?？剐詼p弱，葉片MDA和H2O2含量顯著上升。王靜等[7]的研究表明，在150 mmol·L-1NaCl的脅迫下，約80%的紫花苜蓿植株下部的葉片出現(xiàn)褐斑或卷曲。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)紫花苜蓿在200 mmol·L-1NaCl的脅迫下，幼苗、根的鮮重和長(zhǎng)度均低于對(duì)照。Sandhu等[9]的研究表明，鹽脅迫抑制了紫花苜蓿的生物量和地上長(zhǎng)度。此外，鹽脅迫可減小紫花苜蓿的光合葉面積，抑制凈光合速率和地上部分生物量的增長(zhǎng)[10-11]，也可影響紫花苜蓿Na+、K+和Ca2+的分布，并增加脯氨酸的含量[12]。

NO是重要的氧化還原信號(hào)分子之一，廣泛分布于植物的各種組織，并在植物生長(zhǎng)發(fā)育及鹽害、冷害、干旱和病原菌侵染等脅迫應(yīng)答過(guò)程中起重要作用[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，用NO的外源供體SNP對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行引發(fā)處理能夠打破種子休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)[15]，并且用SNP浸過(guò)的種子萌發(fā)出土后的地上部分明顯高于未浸種的植株。NO可以提高紫花苜蓿在鹽脅迫下對(duì)硝態(tài)氮的利用效率，增強(qiáng)氮代謝酶的活性[16]；亦可緩解滲透脅迫對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片光合效率的抑制作用[17]；周萬(wàn)海等[18]的研究表明NO能減輕鹽脅迫下苜蓿根系生長(zhǎng)所受抑制，并緩解氧化損傷。趙穎等[17]的研究表明，對(duì)滲透脅迫下的紫花苜蓿幼苗施加SNP能顯著緩解葉片葉綠素a及葉綠素b含量的下降，提高類胡蘿卜素含量，促進(jìn)光合色素的合成，提高紫花苜蓿葉片的有效光合面積。

NO作為信號(hào)分子，在植物抗逆過(guò)程中具有重要的作用，目前雖然有對(duì)紫花苜蓿耐鹽性的相關(guān)研究，但外源NO對(duì)不同濃度鹽脅迫下紫花苜蓿生理特性的影響的研究較為缺乏。因此，本研究以中苜1號(hào)紫花苜蓿為材料，探究了在不同濃度的鹽脅迫下，外源NO對(duì)其生長(zhǎng)及膜脂過(guò)氧化的影響，以期為改善鹽堿地紫花苜蓿的生長(zhǎng)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2018年4月-6月在陜西省咸陽(yáng)市楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)實(shí)驗(yàn)溫室內(nèi)進(jìn)行。供試材料為中苜1號(hào)，本研究采用花盆培養(yǎng)，所用石英砂由0.425～0.850 mm、0.212～0.425 mm按1∶2比例混合所得。挑選飽滿、均勻的種子，用蒸餾水沖洗3～5次，隨后用20%次氯酸鈉消毒10 min，并用蒸餾水沖洗3～5次，最后用50 ℃溫水浸種引發(fā)1 h，每盆播種50粒，共60盆。生長(zhǎng)期間定期澆灌1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液。50 d后，開(kāi)始進(jìn)行鹽脅迫和外源NO處理。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)北方鹽堿地的鹽分組成特點(diǎn)，選定NaCl、Na2SO4兩種中性鹽，按一價(jià)陰離子與二價(jià)陰離子之比2∶1將兩種鹽混合，設(shè)置24、72和120 mmol·L-13個(gè)鹽濃度(表1)。每盆苜蓿記作一個(gè)重復(fù)，每組隨機(jī)取3個(gè)重復(fù)。以硝普鈉(SNP)作為外源NO供體，SNP濃度分別為0.05、0.1、0.2和0.3 mmol·L-1(分別記作 N1、N2、N3和 N4)，以蒸餾水為對(duì)照(N0)。分別在第51、53、55和57 天進(jìn)行鹽脅迫處理，每盆每次澆灌200 mL鹽溶液；SNP處理與鹽處理間隔1 d交替進(jìn)行，即第52、54、56和58天施加SNP，處理時(shí)于根部澆灌200 mL，同時(shí)用噴壺于葉面噴施至有均勻水珠滴落。試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照(CK)，即不做鹽處理和SNP處理。處理結(jié)束5 d后對(duì)地上部分取樣，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

表1 試驗(yàn)處理成分表Table 1 Compositions of the different treatments

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 幼苗鮮干重的測(cè)定

取地上樣品，用蒸餾水沖洗，用吸水紙吸凈表面水分測(cè)量鮮重；隨后于105 ℃殺青30 min，70 ℃烘至恒重，稱量測(cè)得干重[16]。

1.3.2 幼苗葉綠素的測(cè)定

紫花苜蓿植株葉綠素a含量(Ca)、葉綠素b含量(Cb)、類胡蘿卜素含量(Cx)和總?cè)~綠素含量(Ct)參照Rekik等[19]的方法，利用95%乙醇研磨、提取和測(cè)定。

1.3.3 相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定

隨機(jī)選取5株苜蓿，利用直徑為1 cm的打孔器在同一位點(diǎn)打取10個(gè)小圓片，去離子水沖洗3次，在裝有10 mL去離子水的試管中將葉片抽真空，并在室溫下震蕩、放置20 min，測(cè)定電導(dǎo)率，記作A1；對(duì)試管進(jìn)行持續(xù)5 min的沸水浴后靜置，待冷卻之后測(cè)定電導(dǎo)率，記作A2。相對(duì)電導(dǎo)率 = A1/A2× 100%[18]。

1.3.4 丙二醛 (MDA)含量的測(cè)定

利用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量[20]。稱取0.3 g樣品，加2 mL 10% TCA和適量石英砂研磨，再用3 mL TCA沖洗轉(zhuǎn)入試管，低溫(4 ℃)下離心10 min(10 000 g)后，保存并記錄上清液體積。取上清液2 mL(TCA為對(duì)照)，加入5 mL 0.5% TBA后，及時(shí)沸水浴10 min，取出于20 ℃水浴中冷卻5 min，取上清液分別于450、532和600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，并按以下公式計(jì)算結(jié)果。

MDA 含 量 = [6.45 × (OD532- OD600) - 0.56 ×OD450] × V1/(V × M)。

式中：V1，測(cè)定所用提取液的體積(mL）；V，提取液總體積(mL)；M，樣品重量(g)；FW，鮮重。

1.3.5 H2O2含量的測(cè)定

參照李合生[20]的方法，稱取葉片0.3 g，加3 mL 0.1% (W∶V)TCA冰浴研磨，并用2 mL TCA沖洗定容至5 mL，于4 ℃下離心10 min(12 000 g)。取上清液 1.0 mL(對(duì)照 1.0 mL 緩沖液)，與 0.5 mL 0.1 mol·L-1pH 7.0磷酸鉀緩沖液，1 mL 1 mol·L-1KI溶液混合，于室溫黑暗下靜置1 h后，測(cè)定390 nm處吸光度。H2O2含量通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。

1.3.6 AsA含量及SOD、CAT和POD活性的測(cè)定

AsA含量的測(cè)定參照Kampfenkel等[21]的方法；SOD活性的測(cè)定參照Prochazkova等[22]的方法，并稍作改進(jìn)；CAT活性的測(cè)定參照Cakmak等[23]方法，并稍作改動(dòng)；POD活性的測(cè)定參照Cakmak等[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan法進(jìn)行多重比較和顯著性差異分析 (α = 0.05)。采用 GraphPad Prism 7.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

2.1.1 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

24 mmol·L-1低鹽脅迫下，紫花苜蓿植株的鮮重與干重顯著降低(P ＜ 0.05)，噴施SNP溶液能夠緩解鮮重、干重所受的抑制，其中N1、N2和N3處理組的鮮重和干重值均超過(guò)了CK (圖1)。在一定SNP濃度范圍內(nèi)，植株干重和鮮重均隨著SNP濃度的升高而上升，干重在0.1 (N2)和鮮重在0.2 mmol·L-1(N3)達(dá)到最大值；繼續(xù)增大SNP濃度，紫花苜蓿的干重和鮮重反而會(huì)有所降低，當(dāng)SNP濃度升至0.3 mmol·L-1(N4)后，植株鮮重顯著低于 N0(P ＜ 0.05)，這說(shuō)明此種條件下SNP對(duì)植物產(chǎn)生了毒害作用。

圖1 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 1 Effects of exogenous NO on the dry weights and fresh weight of alfalfa under a low salt concentration

2.1.2 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

中等鹽脅迫水平(72 mmol·L-1)的紫花苜蓿干、鮮重的變化(圖2)的結(jié)果表明，鹽脅迫下紫花苜蓿的干重和險(xiǎn)種均較對(duì)CK受到了明顯的抑制(P ＜0.05)，而噴施SNP的處理組干重均顯著高于鹽脅迫的N0組(P ＜ 0.05)。與低鹽脅迫濃度相比，干重和鮮重的最適SNP濃度同時(shí)提高至0.3 mmol·L-1(N4)，由此可知，隨著鹽脅迫的增強(qiáng)，紫花苜蓿所需外源NO最適濃度也隨之加大。

2.1.3 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響

由圖3可知，120 mmol·L-1鹽濃度脅迫下，紫花苜蓿干、鮮重的變化規(guī)律與72 mmol·L-1鹽脅迫下相似，干、鮮重與CK相比受到了明顯的抑制(P ＜ 0.05)，且隨著SNP濃度的升高持續(xù)上升。施用 0.3 mmol·L-1(N4)的外源 NO處理組與脅迫組(N0)相比，紫花苜蓿的干重增加了1.351 g，鮮重增加了4.246 g，起到了最大促進(jìn)效果。N4處理組的干重、鮮重均顯著高于處于正常生境下的植株(CK) (P ＜ 0.05)，表明噴施SNP不但緩解了鹽脅迫的抑制作用而且大幅促進(jìn)了紫花苜蓿的生長(zhǎng)。

圖2 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 2 Effects of exogenous NO on the fresh weights, and dry weight of alfalfa under a medium salt concentration

圖3 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿干、鮮重的影響Figure 3 Effects of exogenous NO on the fresh weights, and dry weight of alfalfa under a high salt concentration

2.2 外源NO對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

2.2.1 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

經(jīng)24 mmol·L-1的鹽脅迫處理后，紫花苜蓿葉片中Ca、Cb、Cx和Ct的含量受到了顯著抑制(P ＜ 0.05) (圖 4、圖 5)。而當(dāng)施用 SNP后，5項(xiàng)指標(biāo)均有顯著回升，表明葉片所受的鹽脅迫得到了緩解(P ＜ 0.05)。升高SNP濃度，上述指標(biāo)有所下降，存在高濃度SNP促進(jìn)作用低于低濃度SNP的情況，并且5項(xiàng)指標(biāo)呈現(xiàn)先增高后降低的規(guī)律。

2.2.2 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

72 mmol·L-1的鹽脅迫濃度下，純鹽脅迫組(N0)與 CK相比，Ca、Cb、Cx和 Ct分別降低了44.88%、 28.76%、 52.31%和 39.57%(圖 6、 圖 7)。施加SNP后，Ca、Cb、Cx和Ct較N0處理組顯著升高(P ＜ 0.05)。中等鹽脅迫下，N4處理組較脅迫組Ca/Cb含量顯著提高(P ＜ 0.05)。

2.2.3 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿光合色素含量的影響

鹽脅迫濃度增大至 120 mmol·L-1，Ca、Cb、Cx、Ct的最適SNP濃度分別為N4、N1、N1和N1(圖8、圖9)。高鹽脅迫下，N1對(duì)Cx的促進(jìn)效果最為明顯(P ＜ 0.05)，其 Cx 含量提高至 0.001 538 mg·g-1FW，較脅迫組(N0)提高了98%。

2.3 外源NO對(duì)鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、H2O2和MDA含量的影響

2.3.1 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、H2O2和MDA含量的影響

圖4 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 4 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under low salt concentration

圖5 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜?？?cè)~綠素含量和葉綠素a/b的影響Figure 5 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and chlorophylla/b in alfalfa under low salt concentration

圖6 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 6 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under medium salt concentration

24 mmol·L-1鹽濃度下，紫花苜蓿葉片相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)35.67%，相比于CK顯著升高(P ＜ 0.05) (圖10)。外源施加SNP均能緩解鹽脅迫帶來(lái)的葉片損傷，降低相對(duì)電導(dǎo)率(P ＜ 0.05)。低鹽脅迫下，脅迫組植物葉片過(guò)氧化氫含量較CK組顯著升高(P ＜ 0.05)，升高16.42%。與脅迫組相比，SNP均顯著降低了植物葉片的過(guò)氧化氫含量，其中0.05、0.1 mmol·L-1濃度下的過(guò)氧化氫含量較低。此外，脅迫條件下，紫花苜蓿葉片MDA含量較CK組有顯著增加，增加了14.31%。與脅迫組相(N0)比，除0.3 mmol·L-1SNP處理組，葉片MDA含量均顯著降低，其中0.1 mmol·L-1SNP處理下葉片MDA含量最低。隨著SNP濃度的增加，SNP對(duì)鹽脅迫引起相對(duì)電導(dǎo)率、過(guò)氧化氫含量、MDA含量升高的緩解效果呈現(xiàn)先強(qiáng)后弱的趨勢(shì)。

2.3.2 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、H2O2和MDA含量的影響

圖7 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜?？?cè)~綠素含量和葉綠素ab比值的影響Figure 7 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and Ca/Cb in alfalfa under medium salt concentration

圖8 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿葉綠素a、b及類胡蘿卜素含量的影響Figure 8 Effects of exogenous NO on the chlorophyll a, chlorophyll b and carotenoids contents in alfalfa under high salt concentration

圖9 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜?？?cè)~綠素含量和葉綠素a/b的影響Figure 9 Effects of exogenous NO on the chlorophyll contents and chlorophyll a/b in alfalfa under high salt concentration

提高鹽脅迫濃度至72 mmol·L-1，植物葉片相對(duì)電導(dǎo)率較CK組顯著升高(P ＜ 0.05)，增加到37.66%(圖11)；施加外源NO，所有NO處理組的相對(duì)電導(dǎo)率均顯著降低 (P ＜ 0.05)，0.05、0.1、0.3 mmol·L-1SNP處理組的相對(duì)電導(dǎo)率與CK組差異不顯著(P ＞0.05)。提高外源NO濃度至0.2 mmol·L-1，葉片相對(duì)電導(dǎo)率與CK組相比呈現(xiàn)顯著降低(P ＜ 0.05)，降至19.03%。N0下，過(guò)氧化氫含量與CK相比顯著增加(P ＜ 0.05)，增加了17.21%。施加外源NO，所有處理組的過(guò)氧化氫含量較脅迫組（N0)顯著降低(P ＜ 0.05)。N0下，MDA含量比CK組顯著升高，升高了23.61%；N1、N2、N3、N4處理組與N0相比能夠顯著降低MDA含量，分別降低了9.09%、21.92%、36.58%、25.80%。隨著 SNP濃度的增加，外源NO對(duì)鹽脅迫下葉片損傷帶來(lái)的相對(duì)電導(dǎo)率、過(guò)氧化氫含量、MDA含量的變化的緩解效果由強(qiáng)變?nèi)酢?/p>

圖10 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、MDA和H2O2 的影響Figure 10 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA and H2O2 contents in alfalfa under low salt concentration

圖11 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、MDA和H2O2 的影響Figure 11 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA, and H2O2 contents in alfalfa under medium salt concentration

2.3.3 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、H2O2和MDA含量的影響

120 mmol·L-1鹽脅迫濃度下，N0處理組的相對(duì)電導(dǎo)率與CK相比顯著增加，由22.94%增加到38.86%，外源施加NO后，N1、N2、N3、N4處理組與脅迫組N0相比均顯著降低，分別降至28.27%、23.27%、16.95%、20.53% (圖12)。此脅迫濃度下，植物葉片中過(guò)氧化氫含量與CK相比，顯著增高，增加了25.12%。N1、N2、N3、N4處理組過(guò)氧化氫含量與N0相比均顯著降低(P ＜ 0.05)，其中N3、N4處理較CK含量顯著降低，分別降低了47.48%和24.60%。此外，高鹽脅迫下，植物葉片中MDA含量較CK顯著增加，增加了69.62%，同時(shí)施加外源NO的N1、N2、N3、N4處理組與N0脅迫組相比均顯著降低，分別降低了27.25%、40.11%、56.38%、47.17%?？梢?jiàn)，高鹽脅迫條件下，葉片相對(duì)電導(dǎo)率和過(guò)氧化氫含量會(huì)隨著SNP濃度的增加呈現(xiàn)先降后增的趨勢(shì)，而葉片MDA含量卻隨著SNP濃度的增加，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。

2.4 外源NO對(duì)鹽脅迫下紫花苜?？寡趸富钚院涂箟难岷康挠绊?/h3>

2.4.1 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜?？寡趸富钚院涂箟难岷康挠绊?/p>

當(dāng)脅迫濃度為24 mmol·L-1時(shí)，紫花苜蓿葉片的SOD、CAT活性受到了顯著抑制(P ＜ 0.05)，POD活性有了顯著提升(P ＜ 0.05)，AsA含量也存在一定的下降(圖13)；對(duì)比施用外源NO處理組，結(jié)果顯示，施加NO對(duì)4種指標(biāo)均產(chǎn)生了顯著的促進(jìn)作用(P ＜ 0.05)。N2組的SOD活性最強(qiáng)，與 N0相比提升了61.77% (P ＜ 0.05)；POD與CAT的活性的最大活性值出現(xiàn)于N3處理組。此鹽脅迫濃度下，所有外源NO處理組的AsA含量均超過(guò)了CK，最高含量在N2處理組，其AsA含量與CK和N0相比分別增加61.28%和70.39% (P ＜ 0.05)?？梢?jiàn)，4個(gè)指標(biāo)均存在隨著SNP濃度的提高而先升高后降低的規(guī)律。

圖12 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜蓿相對(duì)電導(dǎo)率、MDA和H2O2 的影響Figure 12 Effects of exogenous NO on the relative electrical conductivity, MDA, and H2O2 contents in alfalfa under high salt concentration

圖13 外源NO對(duì)低濃度鹽脅迫下紫花苜?？寡趸富钚院虯sA含量的影響Figure 13 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under low salt concentration

2.4.2 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和抗壞血酸含量的影響

72 mmol·L-1鹽脅迫下，外源NO施用組與單純脅迫對(duì)照組(N0)相比SOD、POD、CAT、AsA4種指標(biāo)均有了一定的提高(圖14)。施用NO處理后的SOD活性得到了顯著提升(P ＜ 0.05)，N2處理組的SOD活性達(dá)到了最大值。中等鹽脅濃度下，N3處理組AsA含量達(dá)到最高值，較脅迫組與對(duì)照組有顯著提升(P ＜ 0.05)。隨外源NO濃度升高，SOD活性和AsA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，而POD活性持續(xù)升高，并未出現(xiàn)降低的情況。

2.4.3 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜?？寡趸富钚院涂箟难岷康挠绊?/p>

圖14 外源NO對(duì)中等濃度鹽脅迫下紫花苜蓿抗氧化酶活性和AsA含量的影響Figure 14 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under medium salt concentration

當(dāng)鹽脅迫濃度提高至120 mmol·L-1，植株噴施SNP的所有處理組與N0相比(圖15)，依然能夠?qū)?種生理指標(biāo)大部分產(chǎn)生顯著的促進(jìn)作用(P ＜ 0.05)，特別是N4處理與脅迫組間的差異最顯著，其中植株的SOD、POD和CAT活性分別提高了48.22%、107.34%和51.42%。此外，AsA含量隨著SNP濃度的升高持續(xù)上升，N1的AsA含量與N0組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。SOD、POD和CAT的活性隨著SNP濃度升高而持續(xù)增高。高濃度鹽脅迫(120 mmol·L-1)下，上述4種指標(biāo)的最有效SNP濃度均為0.3 mmol·L-1(N4)。

3 討論

植物鮮、干重的波動(dòng)反映了植物生物量的變化，SNP顯著緩解了鹽脅迫對(duì)紫花苜蓿鮮、干重的抑制作用，表明外源NO能夠提高紫花苜?？果}脅迫的能力，有利于保障紫花苜蓿的產(chǎn)量，72和120 mmol·L-1鹽脅迫下施用 0.3 mmol·L-1的 SNP 使紫花苜蓿的鮮重、干重同時(shí)達(dá)到了最高值，說(shuō)明此兩種鹽脅迫下0.3 mmol·L-1SNP對(duì)紫花苜蓿產(chǎn)量促進(jìn)能力最強(qiáng)。低濃度鹽脅迫時(shí)0.3 mmol·L-1的SNP降低了紫花苜蓿的鮮重(P ＜ 0.05)，這證明了外源NO作用的兩重性，此種鹽脅迫下最適SNP濃度介于0.1和0.2 mmol·L-1之間。土壤鹽脅迫會(huì)破壞植物葉綠體的結(jié)構(gòu)，并且激活植物內(nèi)葉綠體酶的活性，造成葉綠體的加速分解，進(jìn)而導(dǎo)致植物葉綠素含量降低[24]。類胡蘿卜素既可作為光和色素，吸收傳遞光能；又可作為植物細(xì)胞的內(nèi)源氧化劑，吸收多余光能，防止發(fā)生細(xì)胞膜脂過(guò)氧化[17]。在本研究中，施加SNP后葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量，以及葉綠素a/b的值均顯著升高(P ＜ 0.05)，這表明外源NO能夠維持紫花苜蓿葉片的光合色素含量，為鹽脅迫環(huán)境下的光合作用提供保障，為植株正常生理生化活動(dòng)提供能量基礎(chǔ)。具體原因可能是施加SNP提高了植物內(nèi)NO含量，其作為信號(hào)分子，激活了葉綠素合成過(guò)程中的相關(guān)酶活性，或是提高與葉綠素結(jié)構(gòu)相關(guān)的礦物質(zhì)元素如Mg等的吸收效率。低鹽濃度脅迫時(shí)，SNP對(duì)Ca、Cx和葉綠素a/b的促進(jìn)作用隨SNP濃度的升高而先增強(qiáng)后減弱，說(shuō)明外源NO對(duì)紫花苜蓿的促進(jìn)作用具有雙重性，并且紫花苜蓿對(duì)SNP的敏感度隨著鹽脅迫濃度的增加而降低。

圖15 外源NO對(duì)高濃度鹽脅迫下紫花苜?？寡趸富钚院虯sA含量的影響Figure 15 Effects of exogenous NO on the antioxidant enzyme activities and AsA content of alfalfa under high salt concentration

在正常生長(zhǎng)條件下，細(xì)胞膜對(duì)胞內(nèi)外物質(zhì)具有選擇透過(guò)性，當(dāng)植物受到鹽漬、高溫、干旱等逆境脅迫影響時(shí)，會(huì)致使細(xì)胞膜的通透性會(huì)增大，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲最終會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞的相對(duì)電導(dǎo)率增大，其增大程度與脅迫強(qiáng)度和植物抗逆能力的強(qiáng)弱緊密相關(guān)。在本研究中，4種濃度的SNP均能顯著降低葉片的相對(duì)電導(dǎo)率(P ＜ 0.05)，但隨著SNP濃度的提高，其葉片電導(dǎo)率并未持續(xù)降低，而是呈先降后升的趨勢(shì)，這與焦娟等[25]試驗(yàn)中0.1和0.2 mmol·L-1SNP能夠增強(qiáng)黃瓜(Cucumis sativus)幼苗抗氧化能力而0.3 mmol·L-1SNP抑制幼苗抗氧化能力的結(jié)果一致。不同的是，0.3 mmol·L-1SNP對(duì)紫花苜?？寡趸芰Φ拇龠M(jìn)作用減弱，并未達(dá)到抑制生長(zhǎng)的程度，此種差異可能是兩種植物對(duì)SNP的敏感程度不同所造成的。

在鹽脅迫條件下，植物會(huì)大量累積H2O2，且對(duì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子起氧化作用，加速細(xì)胞的衰老、死亡[26]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫并導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷，造成嚴(yán)重的氧化傷害，因此，MDA和H2O2含量的高低可直接反映脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，常用作判斷脅迫損傷程度的指標(biāo)。在本研究中，鹽脅迫處理導(dǎo)致苜蓿葉片發(fā)生氧化脅迫使得MDA和H2O2顯著升高和過(guò)量積累，從而影響其正常生長(zhǎng)。SNP能夠顯著降低葉片中MDA和H2O2的積累，減弱鹽脅迫造成的氧化傷害，從而改善紫花苜蓿的生長(zhǎng)。

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)存在著由SOD、CAT和POD等抗氧化酶及AsA等抗氧化物質(zhì)組成的ROS清除系統(tǒng)，可抵御膜脂氧化損傷，保護(hù)植物。馬巧利等[24]研究表明NO能夠激活Cd脅迫下CAT和APX的活性，提高SOD和POD的活性，升高蛋白質(zhì)和谷胱甘肽的表達(dá)量[27]，從而提高ROS的清除效率[17]。植物體內(nèi)的AsA可被氧化為不穩(wěn)定的單脫氫抗壞血酸(MDHA)，后經(jīng)非酶促歧化反應(yīng)生成 DHA[28]。在本研究中，鹽脅迫下的紫花苜蓿葉片SOD活性受到了顯著抑制，而施加SNP使其活性得到顯著提高，增強(qiáng)了ROS的清除效率。在清除H2O2的過(guò)程中，SOD、CAT與POD起協(xié)同作用，3種酶共同保護(hù)植物免受過(guò)氧化作用的損傷。CAT的活性變化與SOD相似。POD活性在植物遭受鹽脅迫后升高，說(shuō)明POD能夠減弱脅迫所造成的活性氧損傷，而施加SNP進(jìn)一步提高了SOD的活性同時(shí)，也對(duì)AsA有顯著的提高作用。這一系列變化促進(jìn)了ROS的清除過(guò)程，說(shuō)明外源NO能夠增強(qiáng)葉片中抗氧化系統(tǒng)中酶的活性和非酶物質(zhì)的含量，以清除過(guò)量的ROS，從而緩解氧化傷害，增強(qiáng)紫花苜蓿對(duì)鹽脅迫的抗性。

外源NO對(duì)植物生長(zhǎng)的作用存在低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的現(xiàn)象，低濃度NO可以增強(qiáng)抗氧化酶的活性，提高植物對(duì)ROS的清除效率，進(jìn)而增強(qiáng)植物的抗逆性；而高濃度的NO可與超氧陰離子相互作用生成過(guò)氧亞硝酸根陰離子，進(jìn)而形成具生物毒性的過(guò)氧亞硝酸[29]。本研究所用不同濃度的SNP(0.05、0.1、0.2 和 0.3 mmol·L-1)對(duì)鹽脅迫下的紫花苜蓿能夠起到緩解脅迫傷害、促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，但本研究也存在高濃度SNP促進(jìn)效果不如低濃度的現(xiàn)象，甚至對(duì)植物產(chǎn)生毒害作用。不同強(qiáng)度鹽脅迫下紫花苜蓿對(duì)外源NO的敏感度不同，此種差異可能與所受脅迫的強(qiáng)度和品種有關(guān)，也可能與處理濃度和時(shí)間有關(guān)[30-32]。相同濃度的SNP對(duì)不同鹽濃度脅迫損傷的緩解能力有所不同，在多數(shù)情況下，其對(duì)低濃度鹽脅迫損傷的修復(fù)能力更強(qiáng)，并且表現(xiàn)出雙重性，即隨著SNP濃度的升高，其對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)的促進(jìn)作用呈先增后減的趨勢(shì)。隨著鹽濃度的升高，紫花苜蓿對(duì)SNP的敏感性下降，最適SNP濃度隨之升高。

4 結(jié)論

1)在不同濃度鹽脅迫下，外源NO可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)中SOD、CAT和POD的活性及AsA的含量，從而緩解氧化損傷，促進(jìn)中苜1號(hào)的生長(zhǎng)，提高其鮮、干重。

2)外源NO對(duì)紫花苜蓿鹽脅迫損傷的緩解作用具有雙重性，其緩解能力隨著濃度的升高而先增強(qiáng)后減弱，且當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)呈現(xiàn)毒害作用。

3)紫花苜蓿所處的鹽脅迫強(qiáng)度越高，其對(duì)外源NO的敏感性越低，所需施用的最適SNP濃度也越高。

4)本研究中 24、72、120 mmol·L-1鹽脅迫下紫花苜蓿對(duì)應(yīng)的最適SNP濃度分別為0.1、0.3和0.3 mmol·L-1。