雙乙酸鈉和糖蜜對秸稈TMR青貯發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性的影響

邱小燕，姚元枝，潘潤澤，李雅思，伍賢進，向孫軍，邵 濤，田玉橋

（1. 懷化學院生物與食品工程學院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008；2. 湖南農業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410123；3. 南京農業(yè)大學飼草調制加工與貯藏研究所，江蘇 南京 210095；4. 湖南省博世康中醫(yī)藥股份有限公司，湖南 懷化 418008）

隨著畜牧業(yè)的不斷發(fā)展，飼料資源短缺成為了急需解決的問題。我國是農作物種植大國，每年可產生大量的水稻(Oryza sativa)和玉米(Zea mays)秸稈，如能將秸稈調配成飼料，既可有效地利用秸稈，又可擴大飼料來源。但秸稈富含粗纖維[1]，未經過加工處理的農作物秸稈是一種劣質的飼料，其適口性差、采食率低，難以被反芻動物消化利用且營養(yǎng)不均衡。發(fā)酵全混合日糧(total mixed ration，TMR)，又稱TMR青貯飼料，是TMR在厭氧條件下發(fā)酵而成的飼料，營養(yǎng)均衡，可維護瘤胃健康，提高生產性能[2]。通過發(fā)酵，可以降解和轉化TMR中的抗營養(yǎng)因子，提高其安全性和利用率，同時可以延長保存時間[3]。但是TMR青貯飼料在運輸過程中容易引起包膜破損，開窖飼喂過程中空氣浸入，易導致TMR青貯飼料發(fā)生有氧腐敗，降低TMR青貯飼料的品質，因此提高TMR青貯飼料的發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性極為重要。

糖蜜是一種高水分含量的食品副產物，其主要成分為糖、蛋白質、維生素等，是常用的青貯發(fā)酵促進劑，可以為乳酸菌的增殖提供底物[4]。陳鑫珠等[5]評價，使用糖蜜作為添加劑，苧麻(Boehmeria nivea)和雜交狼尾草 (Pennisetum americanum ×P.purpureum)混合比例為7∶3青貯料發(fā)酵品質較好。李志春等[6]等在香蕉(Musa nana)莖葉中添加復合乳酸菌、糖蜜和米糠改善了青貯飼料品質，顯著提高青貯飼料的消化利用率和營養(yǎng)價值。雙乙酸鈉是一種用于食品、飼料等領域的防霉保鮮劑，擁有較強的抑菌殺菌能力[7]，使用比較安全，其最終代謝產物為二氧化碳和水，不會殘留在動物體內，對環(huán)境無不良影響，分解產生乙酸改善飼料的適口性，且價格低廉，近年來，被廣泛應用與反芻動物飼料中。劉振陽等[8]分別添加了0.1%、0.3%、0.5%雙乙酸鈉到苜蓿(Medicago sativa)與小麥(Triticum aestivum)的混合青貯中，發(fā)現隨著雙乙酸鈉添加量提高，青貯飼料有氧變質時間明顯延長，且較高的雙乙酸鈉添加量會抑制青貯飼料乳酸菌的活性。張新慧等[9]探討雙乙酸鈉對玉米青貯品質及有氧穩(wěn)定性的影響，表明向青貯原料中添加發(fā)酵抑制劑對提高青貯的質量沒有作用，但可以提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。

本研究以水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)為原料調配成TMR青貯飼料，探究雙乙酸鈉和糖蜜對秸稈TMR青貯發(fā)酵品質及有氧穩(wěn)定性的影響，篩選出適宜的添加劑，為促進奶牛業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

TMR青貯飼料由水稻秸稈、玉米秸稈、全株四棱豆和精料調配而成，水分含量約55%(表1)。水稻、玉米、四棱豆種植于湖南省懷化市當地農田，水稻秸稈和玉米秸稈分別為水稻和玉米去除籽實后的秸稈，全株四棱豆處于結莢期，精料由玉米粉、豆粕、棉粕、麥麩、預混料、DDGS和食鹽組成，購于懷化市市場。TMR青貯飼料配方中原料的化學成分如表2所列。

表1 發(fā)酵全混合日糧的原料構成及化學、微生物成分Table 1 Ingredients and chemical and microbial composition of total mixed ration silages

1.2 試驗設計

試驗設對照組(C，無添加)、雙乙酸鈉添加組(S，0.5%鮮重)、糖蜜添加組(M，3%鮮重)、雙乙酸鈉 + 糖蜜組合添加組(SM，0.5% + 3%鮮重)4組，每個聚乙烯青貯袋里填充8 kg TMR青貯飼料，每個處理設5個重復，抽真空后密封，在25 ℃條件下青貯35 d，開袋測定其發(fā)酵品質，并在有氧暴露0、3、6、9、12和15 d，分別取樣分析有氧穩(wěn)定性。

1.3 試驗方法

1.3.1 前處理

將水稻秸稈、玉米秸稈和全株四棱豆用鍘刀切割成1～2 cm長。按照試驗配方把市購的玉米粉、豆粕、棉粕、麥麩、預混料、DDGS和食鹽等按照比例充分混合配制精料，TMR的調配均以干物質為基礎將原料進行混合，配方參照當地奶牛場采用的配方，奶牛處于泌乳中期，蛋白需要量維持在14%左右，分別稱取雙乙酸鈉、糖蜜，加入去離子水溶解，以便后期與材料充分混合。

1.3.2 化學成分及微生物成分測定

干物質(dry matter, DM)含量的測定：將樣品放入65 ℃烘箱恒溫烘48 h以上至恒重；pH采用PHS-3C雷諾pH計測定；乳酸及揮發(fā)性脂肪酸含量采用氣相色譜儀進行測定，氣相色譜儀為GC-2014型[10]；水溶性碳水化合物含量采用硫酸－蒽酮比色法[10]測定；氨態(tài)氮含量采用苯酚－次氯酸鈉比色法[11]測定；粗蛋白采用KjeltecTM2300型全自動凱氏定氮儀測定；粗脂肪采用殘余法測定；粗灰分采用高溫灼燒法測定，取2 g樣品于550 ℃烘干恒重的坩堝內，先炭化至無煙，然后移入高溫爐中于550 ℃下灼燒4 h后冷卻稱重，恒重；采用Van-soest法[12]應用濾袋技術測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維。緩沖能的測定：首先將樣品提取溶液用0.1 mol·L-1的HCl標準溶液酸化至pH為3，再用 0.1 mol·L-1的 NaOH標準溶液調制 pH為 4，然后繼續(xù)滴定至pH為6，記錄pH從4到6的NaOH消耗體積，然后計算：U = (V1- V0) × C × 1 000/(M × W)。式中：U為緩沖能(mE·kg-1)；V1為消耗NaOH體積 (mL)；V0為空白消耗 NaOH體積 (mL)；C為NaOH濃度(mol·L-1)；M為新鮮樣品質量(g)；W為新鮮樣品干物質含量(%)；。微生物測定：取10 g材料加入 90 mL 滅菌的0.85%的生理鹽水中浸提12 h，后用0.85%的生理鹽水依次稀釋至1 × 10-1～1 × 10-7，用于微生物平板計數。乳酸菌采用 MRS(de-Man Rogosa Sharpe)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，好氧性微生物采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(nutrient ager)，酵母菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)(potato-dextrose agar)。乳酸菌 37 ℃厭氧條件下培養(yǎng) 2～3 d；好氧性細菌和酵母菌于生化培養(yǎng)箱 37 ℃中分別培養(yǎng)1～3 d，計數。

表2 發(fā)酵全混合日糧配方中全株四棱豆、玉米秸稈、水稻秸稈、精料的化學成分Table 2 Chemical composition of whole bead, corn stalk, rice straw, and concentrate used in total mixed ration silages

1.3.3 有氧穩(wěn)定性測定

有氧穩(wěn)定性為青貯飼料在空氣中暴露后其核心溫度比外界溫度高出2 ℃時，需要的小時數[9]。青貯35 d后，進行有氧穩(wěn)定性的測定，青貯開包后，放置于25 ℃恒溫室內，將熱電偶放置于青貯料中心處，用記錄儀記錄青貯飼料的溫度[13]，同時測定 pH、乳酸、碳水化合物、乙酸、丙酸、丁酸含量及微生物數量的變化，這些指標可以反映有氧腐敗的程度。

1.3.4 數據統(tǒng)計

試驗數據采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件對所測數據統(tǒng)計分析，用平均值和標準誤表示測定結果，用鄧肯法(Duncan)對各處理進行多重比較，顯著水平為P ＜ 0.05；采用Excel 2010制圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對TMR發(fā)酵品質的影響

S組pH顯著(P ＜ 0.05)高于M和SM組，C組pH略高于M和SM組，但無顯著差異(P ＞ 0.05) (表3)。S和SM組緩沖能顯著(P ＜ 0.05)高于C組，其中SM組緩沖能最高。M和SM組乳酸含量顯著高于S和C組，C組乳酸含量最低。C組水溶性碳水化合物含量顯著高于S和SM組，C和M組水溶性碳水化合物含量無顯著差異。S組氨態(tài)氮/總氮低于C組但無顯著差異，M和SM組氨態(tài)氮/總氮顯著低于C組，SM組氨態(tài)氮/總氮最低。SM組乙酸含量顯著高于其他3組，C、S和M組乙酸含量無顯著變化。4組丙酸、丁酸含量、乳酸菌、酵母菌及好氧性微生物數量都無顯著差異。

2.2 不同處理對TMR有氧穩(wěn)定性的影響

不同處理TMR有氧穩(wěn)定性如圖1所示，S組的有氧穩(wěn)定性達到312 h，顯著(P ＜ 0.05)高于M和C組，與SM組無顯著性差異(P ＞ 0.05)。

隨著有氧暴露(0～15 d)，C組和M組pH基本呈上升的變化趨勢，在有氧暴露15 d后分別上升至6.30和5.18，顯著高于S和SM組(P ＜ 0.05)，S和SM組pH在整個有氧暴露階段無明顯(P ＞ 0.05)變化(表4)。C組乳酸含量在有氧暴露第9天顯著下降，M和SM組乳酸含量呈下降的趨勢，S組乳酸含量在整個有氧暴露過程中無顯著性變化，其中M和SM組乳酸含量在有氧暴露第0天顯著高于C和S組。在整個有氧暴露過程中，S組和SM組乳酸含量一直較高，各組水溶性碳水化合物含量均表現出下降的趨勢，各添加劑組水溶性碳水化合物含量在有氧暴露第15天顯著高于C組。

圖1 青貯35 d后各添加劑對發(fā)酵全混合日糧有氧穩(wěn)定性的影響Figure 1 Effect of each additive on the aerobic stability of TMR silages after 35 d of ensiling

在TMR發(fā)酵過程中，C組及M組乙酸含量均呈先上升后下降的趨勢(表5)，S組乙酸含量先降后升再降，SM組乙酸含量則呈先下降后上升的趨勢。其中C組和M組乙酸含量在有氧暴露第12天后顯著低于S和SM組(P ＜ 0.05)。在整個有氧暴露過程中，各組丙酸含量均呈下降趨勢，且各組間無顯著(P ＞ 0.05)差異。C組丁酸含量在整個有氧暴露過程中無明顯變化，S和M組丁酸含量呈下降的變化趨勢，SM組丁酸含量基本呈先下降后上升的趨勢，并在第15天顯著上升至1.01 g·kg-1。

表4 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧的pH、乳酸和碳水化合物含量的變化Table 4 Changes in pH, lactic acid, and water-soluble carbohydrates content of total mixed ration silages during exposure to air

表5 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧的乙酸、丙酸和丁酸含量的變化Table 5 Changes in acetic acid, propionic acid, and butyric acid content of total mixed ration silages during exposure to air

各組的好氧性微生物數量隨著有氧暴露時間的延長均呈上升的變化趨勢，但各組間無顯著差異(P ＞ 0.05) (表6)。在剛拆青貯袋(0 d)打破厭氧環(huán)境時，各組乳酸菌數量均處于較高水平(＞ 6 lg cfu·g-1)，各組乳酸菌數量均呈下降的趨勢，并在有氧暴露第15天降到最低，在有氧暴露第3天M組乳酸菌數量顯著(P ＜ 0.05)低于其他3組。C組和M組酵母菌數量分別在有氧暴露第12天和第6天顯著上升至6.28和6.13 lg cfu·g-1，S和SM組酵母菌在整個有氧暴露過程無明顯變化，呈上升的趨勢。

表6 有氧暴露階段發(fā)酵全混合日糧微生物數量變化Table 6 Number changes in microorganism of total mixed ration silages during exposure to air

3 討論

青貯原料是青貯發(fā)酵成功的關鍵，一般認為，原料乳酸菌超過5 lg cfu·g-1FW，可溶性碳水化合物含量超過25～35 g·kg-1DM，干物質含量超過200 g·kg-1FW，才能獲得優(yōu)質青貯料[14]，本研究所用TMR乳酸菌接近5 lg cfu·g-1FW，水溶性碳水化合物含量為58.45 g·kg-1DM，滿足了青貯發(fā)酵成功的條件，青貯35 d后，各組且僅檢測到少量的丙酸 (1.06～1.54 g·kg-1DM)和丁酸 (1.66～4.64 g·kg-1DM)，氨態(tài)氮/總氮也低于100，各組TMR均獲得了較好的發(fā)酵品質。各組的pH都要高于4.2，這可能與青貯材料的干物質含量較高有關，原現軍等[15]的研究表明青貯飼料干物質含量較高時，pH在4.5左右，也能使飼料良好保存。添加糖蜜顯著降低了pH，提高了乳酸含量，這是因為可溶性碳水化合物是糖蜜的主要成分，可以為乳酸菌發(fā)酵增加底物[16]，乳酸菌利用碳水化合物迅速產生大量的乳酸，降低pH，抑制蛋白質和氨基酸的分解[17]，與趙慶杰等[18]的結果一致。添加雙乙酸鈉(包括單獨添加和組合添加)降低了乳酸含量，這可能是由于同型乳酸菌對雙乙酸鈉的耐受性較低，抑制了青貯過程中乳酸的生成，劉振陽等[8]的研究亦表明，較高的雙乙酸鈉添加量會抑制青貯飼料乳酸菌的活性。氨態(tài)氮/總氮主要反映蛋白質和氨基酸的降解程度，含量越低青貯飼料品質越好[19]，組合添加雙乙酸鈉和糖蜜組的氨態(tài)氮/總氮最低，且明顯低于無添加組，可能是由于雙乙酸鈉抑制了丁酸菌等有害微生物的生長，從而降低了蛋白質和氨基酸的分解。這與國衛(wèi)杰等[20]在包裹TMR中添加0.3%和0.5%的雙乙酸鈉能夠抑制有害菌的生長、延長貯存時間的結果一致。

青貯飼料暴露于空氣中時，好氧性微生物開始活動，分解利用青貯發(fā)酵階段產生的乳酸、氨基酸、蛋白質和可溶性碳水化合物，產生氨氣、二氧化碳和水等產物并釋放熱量[14]。通常用青貯飼料在空氣中暴露后其核心溫度比外界溫度高出2 ℃所需要的小時數來表示有氧穩(wěn)定性[13]，其腐敗變化情況亦可由pH的變化來反映。本研究中雙乙酸鈉添加組和組合添加組pH在有氧暴露第12天后依舊保持在4.50左右，維持在較低水平，添加雙乙酸鈉提高了發(fā)酵TMR的有氧穩(wěn)定性，雙乙酸鈉有兩個乙酸根，會緩慢分解并釋放出單分子物質乙酸。乙酸與類脂化合物相似相溶，能滲透到霉菌、酵母等的細胞壁內，干擾細胞間酶的識別、傳遞、轉化，促使蛋白質變性，改變細胞的滲透性，從而起到殺菌作用，并且乙酸也能通過降低物質的pH，來抑菌殺菌[21]。因此，乙酸含量已成為預測青貯有氧穩(wěn)定性優(yōu)劣的主要指標之一，乙酸濃度越高，有氧腐敗的時間相應的延長。酵母菌是有氧腐敗的啟動者，一般認為發(fā)酵TMR酵母菌數量超過5 lg cfu·g-1FW容易發(fā)生有氧腐敗[3]，但是，Nishino等[22]研究表明，乙酸含量較高的發(fā)酵TMR即使酵母菌數量超過6 lg cfu·g-1FW也能保持較高的有氧穩(wěn)定性，乙酸對酵母菌有雙重抑制作用，即厭氧階段抑制酵母的存活，有氧階段抑制酵母的活性[23]，本研究與Plegge等[24]的結果一致，添加雙乙酸鈉提高了乙酸含量，可能抑制了酵母菌的活性。各組乳酸和水溶性碳水化合物含量均呈下降的變化趨勢，這是由于有氧暴露后，厭氧環(huán)境被打破，好養(yǎng)性微生物和酵母菌大量繁殖，水溶性碳水化合物和乳酸被分解成有機酸，且釋放熱量導致飼料內部溫度上升，從而加快了腐敗的速度[25]。Johnson等[26]的研究表明，乳酸和水溶性碳水化合物可以為好氧性微生物、酵母和霉菌的生長繁殖提供底物，造成青貯飼料營養(yǎng)成分的損失，因此，青貯飼料有氧穩(wěn)定性與其乳酸和水溶性碳水化合物含量呈負相關關系。本研究對照組和糖蜜添加組經過35 d的發(fā)酵后，水溶性碳水化合物含量較高，有氧穩(wěn)定性低于單獨添加雙乙酸鈉組，這與Chen等[27]的研究結果一致，添加糖蜜可提高全株玉米TMR青貯飼料的乳酸含量，但不會提高有氧穩(wěn)定性。

4 結論

綜上所述，經過35 d青貯后，各組發(fā)酵TMR均具有良好的發(fā)酵品質，對照組和糖蜜添加組在有氧暴露第9天后有氧腐敗開始出現，雙乙酸鈉添加組可使TMR青貯飼料良好的保存15 d以上，提高TMR青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。因此，添加0.5%的雙乙酸鈉可以提高TMR青貯飼料有氧穩(wěn)定性且不影響發(fā)酵品質，可應用于生產中。