膠原凝膠復合骨髓間充質干細胞對小鼠急性肝衰竭的療效與機制研究

陳笑艷，王經琳，施曉雷

（1.南京醫(yī)科大學 鼓樓臨床醫(yī)學院，江蘇 南京 210005；2.東南大學醫(yī)院 普通外科，江蘇 南京 210008；3.南京鼓樓醫(yī)院 肝膽研究所，江蘇 南京 210008）

急性肝功能衰竭（acute liver failure，ALF）是由多種因素引起的突發(fā)和嚴重的肝損傷，伴有大量肝細胞壞死，進而導致嚴重的肝性腦病、凝血功能障礙、黃疸和進行性多器官功能衰竭。急、慢性肝功能衰竭患者病情險、進展急、預后差，內科藥物治療病死率高達50%～80%[1]。目前肝移植是治療ALF最有效的方法，但其應用受到了供體短缺、手術費用高昂、術后需要長期服用免疫抑制劑等原因的限制，臨床上僅有極少患者可以及時進行肝移植治療[2]。近年來，骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植作為一種新興細胞移植療法，已成為治療ALF的研究熱點[3]?，F(xiàn)階段MSCs移植采用靜脈輸注的方式，但研究發(fā)現(xiàn)只有少量細胞募集到受損組織，并且細胞移植后的較低存活率顯著制約其治療效果[4]。膠原蛋白作為天然細胞外基質，具有良好的生物相容性，因此是理想的生物材料。采用膠原凝膠作為生物支架材料，利用其友好的生物相容性和特有的拓撲三維結構，既可為細胞的靶向遞送提供載體，也可提供細胞生長所需的三維環(huán)境，進而維持并提高MSCs的功能與存活[5]。在本研究中，建立了由D-氨基半乳糖（D-Gal）誘導的小鼠急性肝衰竭模型，探究膠原凝膠對MSCs分化和增殖等生物學效應的影響，通過檢測膠原凝膠復合MSCs移植治療小鼠急性肝衰竭中取得的療效，為膠原凝膠復合MSCs應用于臨床治療急性肝功能衰竭提供實驗基礎和依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

C57BL/6小鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，由南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心提供，實驗動物使用許可證SYXK（蘇）2014-0052。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 實驗試劑：胎牛血清（美國Gibco公司）、LDMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）、胰酶（美國Gibco公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Hyclone公司）、DGal（美國sigma公司）、膠原凝膠（中科院北京遺傳發(fā)育研究所）、RIPA全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物公司）、逆轉錄試劑盒（日本Takara公司）。GAPDH、AKT、p-AKT、Ki-67、PARP、cleaved-Caspase 3和PI3K一抗（美國Abcam公司）、羊抗兔二抗（美國Abcam公司）。

1.2.2 實驗儀器：低溫離心機（德國 Eppendorf 公司）、生物安全柜（美國Thermo公司）、精密電子天平（德國Heraeus公司）、顯微鏡（德國Leica公司）、流式細胞儀（美國Bee ton Dickinson公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠MSCs的分離、培養(yǎng)擴增及鑒定：使用頸椎脫臼法處死4～6周齡的C57BL/6小鼠，無菌條件下剪取小鼠的股骨和脛骨，并清除周圍的軟組織，用PBS清洗后剪去股骨和脛骨的骨端，用L-DMEM培養(yǎng)基沖洗分離出小鼠骨髓，并置于4 ℃離心機，1 200 rpm離心5 min，棄去上清液，用L-DMEM吹打重懸，并接種到25 T的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)基為90%的L-DMEM，10%胎牛血清，在含5% CO2的37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液去除未黏附細胞，每3天換液，用傳至3～6代的MSCs進行實驗。流式細胞儀鑒定MSCs，抗體為CD29、CD34、CD44、CD45、CD90小鼠抗體（美國BD、Biosciences公司）。

1.3.2 掃描電鏡觀察：在超凈臺內將膠原凝膠與MSCs（1×106/mL）等體積比充分混合，經過戊二醛固定，乙醇脫水后，將其暴露在空氣中以逐漸蒸發(fā)脫水劑，直至脫水劑揮發(fā)干燥，并使用掃描電鏡觀察。

1.3.3 小鼠ALF模型構建與分組：將105只雄性C57BL/6小鼠隨機分為5組，每組21只：對照組、ALF組、ALF+膠原凝膠組、MSCs組和膠原凝膠-MSCs組。ALF組、ALF+膠原凝膠組、MSCs組和膠原凝膠-MSCs組中腹腔注射800 mg/kg D-Gal，12 h后分別于肝臟多點注射200 μL PBS、200 μL膠原凝膠、1×106MSCs和1×106膠原凝膠-MSCs，連續(xù)7 d觀察小鼠存活率。

1.3.4 肝功能檢測：采集小鼠第1～7 d的血液，使用全自動生化分析儀檢測血谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平。

1.3.5 組織病理學檢查：取小鼠第1、3、7天肝臟，4%多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及Ki-67、cleaved-Caspase3免疫組化檢測，光學顯微鏡觀察并采集圖像。

1.3.6 蛋白免疫印跡（Western blotting）檢測：使用RIPA全蛋白提取試劑盒在4 ℃下提取肝組織中的蛋白。通過BCA蛋白定量法測定蛋白濃度。等量的蛋白經12% SDS-PAGE電泳分離，濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育過夜。在孵育二抗2 h后，用增強化學發(fā)光試劑壓片曝光顯示免疫反應條帶。

1.3.7 RT-qPCR檢測：Trizol法提取小鼠肝組織中RNA。使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以β-actin作為內參，實時熒光定量PCR檢測肝組織中iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α、CCl2表達水平，引物序列見表1。

1.3.8 小動物活體成像：ALF誘導12 h后，將經熒光預處理的1×106MSCs、包含1×106MSCs的膠原凝膠復合MSCs肝臟多點注入ALF小鼠的肝臟，進行小動物活體成像檢測，并采集圖像。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 MSCs的培養(yǎng)和鑒定

小鼠骨髓來源的MSCs表現(xiàn)為紡錘狀、梭型，流式細胞顯示間質標志物CD29、CD44、CD90表達陽性，而造血標志物CD34、CD45表達較少，這表明培養(yǎng)至第三代后的MSCs的純度較高（圖1A）。

2.2 膠原凝膠促進MSCs肝臟定植

為了評價膠原凝膠是否能為MSCs生長提供三維環(huán)境，維持和提高MSCs的功能與存活，我們將膠原凝膠與MSCs混合制備。在掃描電鏡下觀察，可見MSCs黏附于膠原凝膠構建的三維空間中，表明膠原凝膠有良好的生物相容性，能為MSCs細胞生長提供三維環(huán)境，提供移植細胞所需的生存空間（圖1B）。接下來我們繼續(xù)探究膠原凝膠復合MSCs是否能夠更好的定植于ALF小鼠肝臟。小鼠腹腔注射DGal 12 h后，分別對ALF小鼠肝臟多點注射經熒光處理后的MSCs和膠原凝膠復合MSCs，動物活體成像可見幾乎所有信號均集中于肝臟，脾臟位置無信號，說明MSCs主要分布于肝臟，其他臟器無定植，移植膠原凝膠復合MSCs的信號強于單獨移植MSCs的ALF小鼠（圖1C）。因此，采用膠原凝膠復合MSCs能夠提高MSCs在肝臟的定植。

表1 引物序列

圖1 膠原凝膠復合MSCs肝臟定植情況評估

2.3 膠原凝膠復合MSCs移植能有效減輕小鼠ALF

為確定膠原凝膠復合MSCs對ALF小鼠的療效，我們統(tǒng)計ALF小鼠生存率，結果顯示ALF組和ALF+膠原凝膠組小鼠3 d生存率不足15%，二者無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），MSCs組小鼠7 d生存率為43%，膠原凝膠-MSCs組小鼠生存率顯著高于MSCs組（7 d生存率76%）（P＜0.05）（ 圖2A）。各組ALF小鼠的血清ALT、AST均在第3天達到峰值，HE染色也顯示ALF組和ALF+膠原凝膠組第3天肝組織表現(xiàn)為大面積大結節(jié)、淋巴細胞嚴重浸潤、肝細胞壞死、全小葉出血、肝細胞胞漿腫大，表明D-Gal處理后第3天小鼠肝損傷程度最為嚴重（圖2C）。與ALF組和ALF+膠原凝膠組相比，MSCs治療組的ALT和AST水平在各時間點均顯著降低（P＜0.05），膠原凝膠-MSCs組下降更顯著（P＜0.05） （圖2B，由于對照組小鼠ALT和AST指標正常，未在圖中列出）。HE染色也顯示膠原凝膠-MSCs組較MSCs組組織損傷改善更明顯，肝臟損傷程度減輕，中央靜脈周圍壞死程度減輕，淋巴細胞浸潤減少，肝小葉結構未見明顯紊亂（圖2C）。因此，移植膠原凝膠復合MSCs可以有效改善ALF小鼠的肝臟損傷。因此，移植膠原凝膠復合MSCs對于ALF具有更好的治療效果。

2.4 膠原凝膠復合MSCs通過抑制細胞凋亡和促進細胞增殖減輕肝損傷

ALF通常發(fā)生肝細胞凋亡和出血性壞死[6]。為了探究膠原凝膠復合MSCs如何緩解ALF，我們首先檢測肝細胞凋亡水平。cleaved-Caspase 3染色顯示，相比MSCs組，膠原凝膠-MSCs組細胞凋亡明顯減少（圖3A）。Western blotting顯示，在膠原凝膠-MSCs組中促凋亡蛋白Bax和PARP1顯著降低，而抗凋亡蛋白Bcl2表達更高（圖3B）。此外，我們檢測第3天各組小鼠肝臟中的炎性因子水平，結果也顯示移植膠原凝膠-MSCs較MSCs組能更顯著的降低IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CCl2等炎性因子水平（圖3C，由于對照組小鼠炎性指標正常，未在圖中列出）。表明膠原凝膠-MSCs可顯著降低肝細胞凋亡和肝臟炎癥水平。肝臟損傷后肝細胞可重新獲得增殖能力，但在ALF中，肝細胞增殖能力無法代償肝臟損傷，因此促進肝細胞再生也是緩解ALF的重要策略[7]。研究顯示膠原凝膠-MSCs組中Ki-67陽性的肝細胞數目明顯多于MSCs組（圖3D），相應的增殖相關蛋白PCNA和cyclin D1的表達水平在膠原凝膠-MSCs組表達也更高（圖3B）。綜上所述，與MSCs組相比，膠原凝膠-MSCs可更好的通過抑制肝細胞凋亡和促進肝細胞增殖減輕D-Gal誘導的肝損傷。

2.5 移植膠原凝膠復合MSCs調控PI3K/AKT信號通路改善肝細胞功能

研究表明PI3K/AKT信號通路是細胞內重要的信號轉導通路，在細胞的存活、抗凋亡和增殖中發(fā)揮重要的生物調節(jié)功能[8]。因此我們推測膠原凝膠復合MSCs是否通過調控PI3K/AKT信號通路來發(fā)揮肝臟保護作用。結果顯示，移植MSCs組和膠原凝膠復合MSCs組治療均可以激活PI3K/AKT信號通路，膠原凝膠復合MSCs組激活該通路效果顯著優(yōu)于單獨移植MSCs組（圖4）。因此，膠原凝膠復合MSCs促進PI3K/AKT通路的激活，抑制D-Gal誘導的肝損傷的凋亡，改善肝細胞功能。

圖2 膠原凝膠-MSCs提高MSCs對于ALF的治療效果

圖3 膠原凝膠-MSCs通過減輕肝臟損傷并促進肝臟再生緩解ALF

3 討論

ALF是具有高死亡率的臨床重癥，表現(xiàn)為肝細胞功能迅速紊亂，并伴有不可控的全身炎癥反應[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植是更簡單、侵入性更小的手術，因此基于細胞的治療已經被提議作為ALF肝移植的一種切實可行的替代方案[3]。我們課題組前期的研究已經明確MSCs對ALF的治療作用[9-10]，國內其他相關研究也同樣證實了這一結論[11]。然而，隨著對MSCs研究的深入，MSCs低存活率和高凋亡率顯著降低了其治療效果，因此如何增加細胞定向遷移的數量，將足夠量的MSCs有效的遞送到受損組織，是干細胞移植的關鍵因素[12]。近年來，用生物材料承載干細胞可提升干細胞的治療效果已得到廣泛認可[13-14]。膠原凝膠是一種水凝膠，具有水凝膠的特性，可以形成立體三維網狀支架，同時膠原蛋白是一種天然來源的高分子蛋白質，它具有來源方便、無毒、低免疫原性和體內可降解等優(yōu)勢[5]。膠原蛋白作為細胞外基質的主要成分，具有良好的生物相容性，是一種理想的生物材料。它不僅提供細胞的靶向遞送的載體，同時對細胞黏附和組織三維重建提供支架作用，因此可以提高移植細胞的運輸效率，并且可以提供移植細胞在體內所需的生存空間，進而可以增加移植細胞的存活率，并有助于在一定程度上改善單純的干細胞移植所存在的滯留率和存活率低而使治療效果受限的問題[5，15]。本實驗表明，膠原凝膠本身對ALF無治療作用，但能明顯提高MSCs在肝臟的定植率，同時通過對生存率和肝功能等的檢測，表明膠原凝膠能提高MSCs對于ALF的治療效果。

圖4 膠原凝膠-MSCs激活肝臟內PI3K/AKT通路

我們進一步通過免疫組化，證實膠原凝膠復合MSCs可以顯著減輕肝細胞凋亡和肝臟損傷，肝臟內TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性因子的表達明顯降低。同時Ki-67組化和增殖相關蛋白的結果顯示膠原凝膠復合MSCs還可以提高損傷后肝細胞的增殖能力，進而提高對于肝損傷的代償能力，促進ALF肝臟的恢復。同時，我們證實PI3K/AKT通路在膠原凝膠復合MSCs緩解ALF中發(fā)揮重要作用。這項研究中，我們證明了移植膠原凝膠復合MSCs在治療D-Gal誘導的ALF方面表現(xiàn)出優(yōu)異的療效。這表明移植膠原凝膠復合MSCs可以作為優(yōu)化MSCs治療ALF的新方法。

基于實驗結果，我們認為，通過對MSCs進行預處理，膠原支架和MSCs的結合可能是一種針對ALF的重要而有效的治療方法。本實驗也存在一些不足，并未能深入探討膠原凝膠復合MSCs治療ALF的具體機制，后續(xù)將對其治療機制進一步的探索與研究，并將研究結果用于臨床，為膠原凝膠復合MSCs移植治療急性肝衰竭的臨床應用提供新的理論依據和參考。