分揀微管連接蛋白17在重癥肌無力中的表達(dá)及相關(guān)性分析

馬健鈺

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是最常見的神經(jīng)肌肉接頭免疫疾病，以突觸后膜乙酰膽堿受體數(shù)量減少、結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的終板膜崩解為主要病理特征。研究［1］發(fā)現(xiàn)重癥肌無力可受多基因調(diào)控并具有較高的遺傳傾向，與免疫球蛋白重鏈基因、T細(xì)胞受體基因及乙酰膽堿受體均具有密切聯(lián)系。

研究［2］證實低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白與膜表面MuSK形成的復(fù)合體對于神經(jīng)肌肉接頭的功能至關(guān)重要。此外，先前的研究［3］發(fā)現(xiàn)重癥肌無力病人的肌肉組織分揀微管連接蛋白17（sorting nexin 17，SNX17）表達(dá)水平較高，與乙酰膽堿受體亞單位基因共定位于神經(jīng)肌肉接頭，低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 4（low density lipoprotein receptor-relatedprotein，LRP4）在細(xì)胞內(nèi)的代謝與SNX17關(guān)系密切，但國內(nèi)研究資料較少。故此，本研究就SNX17蛋白在重癥肌無力中的表達(dá)情況，并分析其與重癥肌無力發(fā)病的關(guān)系，探討其臨床意義，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年10月至2016年12月南陽市第一人民醫(yī)院確診的重癥肌無力病人（MG組）80例（MG組）、健康對象50例（對照組）。MG組，男性43例，女性37例，年齡范圍為25～56歲，年齡（37.6±11.2）歲，；病臨床分期Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期17例；Ⅳ期21例；胸腺瘤22例，胸腺增生18例，眼肌型16例，全身型24例；對照組，男性30例，女性20例，年齡范圍為23～52歲，年齡（35.5±10.3）歲，無MG及其他自身免疫性疾病。兩組病人的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝1.072，χ2＝0.488，P＝0.286、0.347）。病人或近親屬對研究方案均簽署知情同意書。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)［4］

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①術(shù)前未合并其他部位疾??；②術(shù)后病理證實為重癥肌無力；③手術(shù)根治性切除胸腺組織；④有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告及隨訪資料；⑤無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內(nèi)膜異位癥等疾病，近期均未服影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者。②未能完成隨訪者。③貧血及凝血功能障礙；④風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾??；⑤嚴(yán)重的肝腎功能疾病；⑥甲狀腺功能障礙；⑦因其他部位腫瘤進(jìn)行過放化療治療者。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）、免疫組化染色方法、蛋白質(zhì)印跡法SNX17引物依據(jù)Genebank公司合成的SNX17和β-actin基因序列設(shè)計TRIzol法提取胸腺總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；具體反應(yīng)體系參照朱明振等［5］的研究，MG組與對照組SNX17、cDNA及內(nèi)參β-action引物一起擴(kuò)增。

免疫組化染色法觀察胸腺組織SNX17分子形態(tài)，待檢組織甲醛固定后在波片上將單根肌絲剝離，5%BSA 1h封閉后，1∶50鼠抗人SNX17抗體4℃孵育過夜；30 min的37℃復(fù)溫，1∶100AF-g350標(biāo)記羊抗鼠抗體和α-BTX，1 h孵育（37℃），顯微鏡下觀察不同激發(fā)光下的SNX17形態(tài)和分布情況［6］。

蛋白印跡法檢測胸腺細(xì)胞中SNX17的蛋白含量，待檢標(biāo)本研磨成勻漿后加入裂解液，30 min室溫避光保存30 min，離心（5 000 r/min）5 min后取上清，BCA法側(cè)蛋白濃度，β-actin為內(nèi)參，每孔20 uL樣品，1∶1 000鼠抗人SNX17抗體和1∶2 000兔抗人β-actin抗體4℃孵育過夜，30 min的37℃復(fù)溫，1∶4 000 HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體和1∶4 000 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體1 h孵育（37℃），曝光膠片，Quantity One軟件測定［7］。

1.4 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 陰性對照用PBS代替一抗進(jìn)行染色，結(jié)果做為陰性；標(biāo)準(zhǔn)光鏡下以細(xì)胞漿、膜中出現(xiàn)細(xì)胞核著色或粗細(xì)一致的棕黃色顆粒為陽性染色；采取二次計分法：先將染色按強(qiáng)度計分：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。再將陽性細(xì)胞百分比計分，0分為陽性細(xì)胞為＜25%，1分為25%．50%，2分為51%．75%，3分為≥75%。用染色強(qiáng)度得分與細(xì)胞數(shù)得分之和作為判斷表達(dá)的結(jié)果，0分為陰性（-），1～2分為弱陽性（+），3～4分為中等陽性（++），5～6分為強(qiáng)陽性（+++）。所有病理切片均由高年資病理醫(yī)師盲法評定結(jié)果［8］。

1.4.2RT-PCR、蛋白質(zhì)印跡判定標(biāo)準(zhǔn) 分別以每例標(biāo)本SNXl7與β-actin Ct值之比，作為該例標(biāo)本目的基因mRNA的相對表達(dá)量；蛋白質(zhì)印跡曝光結(jié)果以膠片上出現(xiàn)目SNX17和β-actin內(nèi)參條帶，且β-actin內(nèi)參基因的曝光條帶在MG組和對照組灰度一樣［9］。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法統(tǒng)計軟件采用SPSS 17.0，計量資料采用±s進(jìn)行統(tǒng)計描述，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織標(biāo)本中SNX17蛋白的表達(dá)情況比較SNX17蛋白在重癥肌無力胸腺組織中的表達(dá)明顯高于對照組（χ2＝28.208，P＝0.000），見表1。

表1 重癥肌無力病人和健康對照者組織標(biāo)本中SNX17蛋白表達(dá)情況比較

2.2 兩組組織標(biāo)本中SNX17 mRNA及蛋白的表達(dá)水平比較MG組SNX17 mRNA含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。SNX17蛋白含量明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表3。

表2 重癥肌無力病人和健康對照者標(biāo)本中SNX17 mRNA含量比較

表3 重癥肌無力病人和健康對照者標(biāo)本中SNX17蛋白含量比較

2.3 重癥肌無力胸腺組織標(biāo)本中的SNX17蛋白表達(dá)與病人臨床病理學(xué)特征的關(guān)系SNX17蛋白表達(dá)和相對含量在不同的性別、年齡、臨床分期、組織學(xué)分級間比較，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 重癥肌無力胸腺組織SNX17蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系/例（%）

3 討論

MG屬于一類自身免疫性疾病，年發(fā)病率為4～11/100萬，患病率為77～150/100萬，女性患病率大于男性，約3∶2，各年齡段均有發(fā)病，本病臨床表現(xiàn)多樣，存在全身骨骼肌無力和易疲勞等表現(xiàn)［10］。MG主要有兩種病理變化：（1）神經(jīng)-肌肉接頭突觸后膜終板膜乙酰膽堿受體亞單位基因數(shù)量減少；（2）是胸腺異常，主要涉及AChR抗體、MuSK抗體和LRP4抗體加速相應(yīng)自身抗原溶解或直接抑制其功能，阻礙AChR在突觸后膜聚集，影響神經(jīng)沖動的傳遞，進(jìn)而導(dǎo)致肌無力［11］。

最新的研究［12］在胞膜內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)現(xiàn)了重要的新型調(diào)節(jié)蛋白家族—SNX家族，該家族主要位于細(xì)胞溶酶體內(nèi)，它們的過度表達(dá)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)運(yùn)并位于早期內(nèi)涵體小室的特殊部位，被鑒定為和LDLR家族成員相互作用的合體。因此，MG病人淋巴細(xì)胞分化程度與胸腺SNX17表達(dá)密切相關(guān)，高表達(dá)的SNX17可促使胸腺細(xì)胞內(nèi)吞率上升，并以此影響病人免疫功能，最終參與MG。但目前國內(nèi)研究資料較少，本研究深入探討了SNX17蛋白在重癥肌無力中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示SNX17 mRNA及蛋白在重癥肌無力病人中表達(dá)水平明顯高于對照組（P＜0.05），說明SNX17蛋白與重癥肌無力發(fā)病具有密切的關(guān)聯(lián)，這也與先前的研究相符［13］。

SNX17蛋白屬于部分細(xì)胞表面短暫表達(dá)的細(xì)胞粘附蛋白，與血小板選擇蛋白胞漿結(jié)構(gòu)具有相互作用，并調(diào)節(jié)粒細(xì)胞與血小板選擇蛋白的相互作用［13］。LDLR具有重要的膽固醇代謝及脂肪代謝的調(diào)節(jié)作用，作為重要的細(xì)胞膜蛋白，可介導(dǎo)血漿低密度脂蛋白在細(xì)胞間的出入。因而，SNXl7的高度表達(dá)可能導(dǎo)致病人脂肪代謝紊亂，參與MG的發(fā)病、發(fā)展過程。此外，研究［14］提示SNXl7的高度表達(dá)能影響淋巴細(xì)胞的分化，增強(qiáng)胸腺細(xì)胞內(nèi)吞率，進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能并參與MG發(fā)生過程。研究［15-16］報道SNX17能降低溶酶體降解速率并抑制血小板選擇蛋白進(jìn)入溶酶體，并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的細(xì)胞非正常增殖，導(dǎo)致機(jī)體合并免疫耐受終止癥狀。因此，臨床研究認(rèn)為SNX17可通過介導(dǎo)溶酶體的活性，誘使T淋巴細(xì)胞的異常增殖而誘發(fā)MG。本研究發(fā)現(xiàn)SNX17蛋白的表達(dá)與病人組織學(xué)分化程度、臨床病理學(xué)分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無明顯關(guān)系。上述結(jié)果提示SNX17蛋白與MG的發(fā)展過程并無顯著聯(lián)系，但具體機(jī)制還需要相關(guān)研究深入探討、證實。

綜上所述，SNX17蛋白與重癥肌無力發(fā)病具有密切的關(guān)聯(lián)，與臨床病理參數(shù)無明顯的關(guān)系。