基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定尿路感染病原菌

張才慶，李艷，吳青

尿路感染是臨床最常見的感染性疾病之一，也是醫(yī)院獲得性感染的主要病因［1］。如今國內(nèi)、國外診斷尿路感染的唯一標(biāo)準(zhǔn)仍然為中段尿培養(yǎng)［2］。但是這種方法往往要經(jīng)過2～5 d才能得出細(xì)菌鑒定及藥敏結(jié)果，不能及時(shí)為臨床診斷治療提供病原學(xué)依據(jù)。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年發(fā)展起來的一種新型細(xì)菌鑒定技術(shù)，不但可以直接快速鑒定單個(gè)純化菌落，而且可用于一些無菌體液樣本如腦脊液、血液、膽汁、胸水、腹水的直接鑒定，大大地縮短了鑒定檢測(cè)時(shí)間［3-6］。它以敏感、快速、高效的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于臨床微生物的鑒定，顯著降低了樣本檢測(cè)的周轉(zhuǎn)時(shí)間和成本［7-8］，該方法無需進(jìn)行常規(guī)的革蘭染色、生化反應(yīng)等，僅在幾分鐘之內(nèi)就可完成鑒定比對(duì)，操作簡便、快速、高通量、低耗材成本。目前MALDI-TOF MS主要應(yīng)用于對(duì)經(jīng)培養(yǎng)的單個(gè)菌落的鑒定，它能夠快速準(zhǔn)確地鑒定臨床常見細(xì)菌和真菌，被認(rèn)為是最有效率的鑒定方法之一［9］。本研究先通過對(duì)菌尿液進(jìn)行差速離心富集，然后運(yùn)用MALDITOF MS技術(shù)對(duì)富集后的菌尿進(jìn)行快速準(zhǔn)確的直接鑒定，有效縮短了檢測(cè)時(shí)間，而且鑒定準(zhǔn)確率高，旨在為尿路感染的及時(shí)診斷提供一個(gè)有效可行的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，同時(shí)將不同濃度的常見病原菌倍比稀釋研究細(xì)菌被鑒定的最低檢測(cè)限度。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源收集2017年6月至2018年11月武漢大學(xué)人民醫(yī)院住院4 493例疑似泌尿系感染病人送檢的清潔中段尿，其中男性1 307例，女性3 186例。病人年齡（59.6±19.1）歲，年齡范圍為16～104歲，其中＜30歲者596例，30～＜60歲者1 545例，60～＜90歲者2 279例，≥90歲者73例。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人或者近親屬均簽署知情同意書。本次報(bào)道遵守《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》［10］所有規(guī)則。

1.2 主要設(shè)備及其配套試劑MALDI-TOF MS儀及配套主要試劑來自德國布魯克公司，Phoenix-100全自動(dòng)細(xì)菌快速鑒定（ID）和藥物敏感試驗(yàn)（AST）檢測(cè)儀及配套試劑和上機(jī)板條來自美國碧迪公司，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂平板來自廣州市迪景微生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定法 采用差速離心法富集。取混勻的中段尿液標(biāo)本1 mL于1.5 mL EP管中，2 000×g離心30 s，取上清，于16 000×g離心5 min后取沉渣并用無菌0.9%氯化鈉溶液500μL充分震蕩混勻后12 000×g離心5 min，棄上清，再用1 mL去離子水洗滌沉淀，同樣轉(zhuǎn)速和時(shí)間離心棄上清液。用加樣器吸取1μL點(diǎn)靶于96孔靶板上，待室溫自然干燥后，加1μL 70%甲酸，混勻室溫干燥后再加0.8μL70%甲酸，2次甲酸（為了更好地破壞細(xì)胞壁較厚的革蘭陽性桿菌或酵母菌）自然干燥后加入1μL基質(zhì)溶液仔細(xì)涂敷在每個(gè)樣本上（樣本晾干后必須在30 min內(nèi)添加基質(zhì)），將晾干的MALDI靶板立即放入質(zhì)譜儀中?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀采集的質(zhì)譜圖使用軟件BioTyper和FlexAnalysis進(jìn)行比對(duì)分析，查看每個(gè)樣本的分類結(jié)果報(bào)告分值。以得分情況判定：2.300～3.000說明高置信度的種水平鑒定，結(jié)果顯示綠色；2.00～2.299說明確定的屬水平鑒定，可能的種水平鑒定，結(jié)果顯示綠色；1.700～1.999說明可能的屬水平鑒定，結(jié)果顯示黃色；0.000～1.699說明不可靠的鑒定，結(jié)果顯示紅色。

1.3.2傳統(tǒng)尿液標(biāo)本培養(yǎng)陽性病原菌鑒定法 用無菌10μL定量接種環(huán)分別取尿液接種于哥倫比亞血瓊脂平板（十字半定量劃線）和麥康凱Macc平板（三區(qū)劃線）上，35℃培養(yǎng)18～48 h，按照作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，即平板生長菌落數(shù)×100為每毫升尿液的菌落數(shù)，同時(shí)采用Phoenix-100全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏儀進(jìn)行菌落鑒定。根據(jù)菌落特點(diǎn)、染色和鏡下形態(tài)，Phoenix-100儀器對(duì)菌落鑒定不出來或者不準(zhǔn)確時(shí)采用其他手工方法進(jìn)行鑒定。

1.3.3尿培養(yǎng)陽性病原菌的純化后MALDI-TOF MS鑒定法 尿培養(yǎng)陽性病原菌純化后單個(gè)菌落進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定。

收集單一常見病原菌感染尿培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行純化菌落、倍比稀釋重新質(zhì)譜分析檢測(cè)最低限度濃度。

1.4 質(zhì)控菌種和儀器校準(zhǔn)株大腸埃希菌ATCC25922，肺炎鏈球菌ATCC49619，金黃色葡萄球菌ATCC25923，白色念珠菌（ATCC10231），光滑念珠菌（ATCC MYA-2950）均由湖北省臨床檢驗(yàn)中心提供。化膿鏈球菌和福氏志賀菌均為質(zhì)評(píng)菌株，分別用來做哥倫比亞血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板的質(zhì)控。

2 結(jié)果

2.1 尿細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果2017年6月至2018年11月共收集清潔中段尿培養(yǎng)標(biāo)本4 493份，尿細(xì)菌培養(yǎng)菌落計(jì)數(shù)≥105cfu/mL的標(biāo)本有1 093份（24.3%）；其中單一細(xì)菌尿路感染的樣本775例（70.9%），2種細(xì)菌感染的樣本183例（16.7%），3種及3種以上細(xì)菌感染的樣本135例（12.4%）；菌落計(jì)數(shù)＜105cfu/mL的標(biāo)本有1125份（25.0%），普通培養(yǎng)無細(xì)菌生長的標(biāo)本有2 275份（50.6%）。

2.2 單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定和菌落培養(yǎng)純化后質(zhì)譜鑒定結(jié)果的比較4 493例標(biāo)本中培養(yǎng)純化后菌落鑒定775例僅含1種菌，而質(zhì)譜直接鑒定有663份陽性，其陽性鑒定率為85.55%（663/775）；在775個(gè)單菌株所致尿路感染樣本中，菌株的屬、種鑒定符合率分別為85.55%（663/775）和83.10%（644/775），其中557株革蘭陰性菌屬、種鑒定符合率分別為94.80%（528/557）和94.08%（524/557），159株革蘭陽性菌屬、種鑒定符合率分別為71.07%（113/159）和64.78%（103/159），59例真菌屬、種鑒定符合率分別為37.29%（22/59）和28.81%（17/59）。單一菌尿路感染，經(jīng)培養(yǎng)純化菌落鑒定MALDI-TOF MS和Phoenix-100/其他b比較，鑒定結(jié)果相符。見表1。

表1 單一菌尿路感染質(zhì)譜直接鑒定和菌落最終鑒定結(jié)果的比較/株

2.3 單一菌株尿路感染樣本直接質(zhì)譜鑒定分值分布單一菌株尿路感染標(biāo)本直接質(zhì)譜鑒定中，尿培養(yǎng)陽性細(xì)菌經(jīng)富集后MALDI-TOF MS檢測(cè)，鑒定分值＞1.700占84.26%（653/775），其中革蘭陰性菌占94.80%（528/557），革蘭陽性菌64.78%（103/159），真菌占37.29%（22/59）。見表2。

表2 單一菌株尿路感染樣本直接質(zhì)譜鑒定分值分布/株

2.4 兩種混合菌感染尿標(biāo)本的菌種檢出情況培養(yǎng)純化后質(zhì)譜鑒定優(yōu)勢(shì)菌的標(biāo)本183份中，由尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定出優(yōu)勢(shì)菌的有134例，直接質(zhì)譜鑒定率為73.22%（134/183）。尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表3。

表3 兩種混合菌感染尿標(biāo)本的菌種檢出情況

2.5 尿路感染常見菌倍比稀釋后的MALDI-TOF MS評(píng)分大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、屎腸球菌運(yùn)用此方法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定得出可靠鑒定結(jié)果的最低檢測(cè)限度分別是1.5×104、1.5×105、1.5×105、1.5×106、1.5×106cfu/mL。見表4。

表4 尿路感染常見菌倍比稀釋后的MALDI-TOF MS評(píng)分

3 討論

MALDI-TOF MS技術(shù)可用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等多種生物分子的分子量和結(jié)構(gòu)分析。其基本原理為：在MALDI離子源部分，基質(zhì)與樣本形成共晶體后，從激光中吸收能量使樣本解吸，基質(zhì)與樣本間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣本分子電離；在TOF MS分析器部分，離子在電場(chǎng)作用下加速飛過飛行管道，飛行時(shí)間與離子的質(zhì)荷比成正比，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間可測(cè)出質(zhì)荷比，通過軟件處理就能得到病原菌特征性的指紋圖譜［11］。將采集到的譜圖與系統(tǒng)內(nèi)置數(shù)據(jù)庫中的所有可用的參考譜圖進(jìn)行比較，從而從種的水平上鑒定細(xì)菌。MALDI-TOF MS技術(shù)在對(duì)經(jīng)培養(yǎng)分離出的菌落進(jìn)行菌種鑒定時(shí)具有高度的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性，極大縮短了傳統(tǒng)菌株鑒定的時(shí)間，而且其成本也降低了許多［12-14］。本文中單菌株尿路感染，革蘭陰性菌通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)直接鑒定有可靠的鑒定結(jié)果，但是與最終鑒定結(jié)果不相同的有9株，它們?yōu)樽罱K鑒定是弗勞地檸檬酸桿菌3株被鑒定為大腸埃希菌，最終鑒定是產(chǎn)酸克雷伯菌3株被鑒定為肺炎克雷伯菌，最終鑒定為普通變形桿菌2株直接鑒定為奇異變形桿菌了，1株約氏不動(dòng)桿菌被鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌了。革蘭陽性菌中直接鑒定有結(jié)果但與最終鑒定不一致的主要有10株，分別是最終鑒定為溶血葡萄球菌直接被鑒定成了金黃色葡萄球菌2株，最終鑒定為屎腸球菌直接鑒定糞腸球菌5株，最終鑒定為表皮葡萄球菌1株被鑒定成了腐生葡萄球菌，2株無乳鏈球菌鑒定成了鏈球菌屬。在念珠菌中，光滑念珠菌4株和白色念珠菌1株被鑒定為酵母菌。同時(shí)將尿路感染常見病原菌作倍比稀釋進(jìn)行MALDI-TOF MS，我們發(fā)現(xiàn)在104cfu/mL革蘭陰性菌比革蘭陽性菌和真菌的質(zhì)譜鑒定率高。很明顯，不同濃度的細(xì)菌計(jì)數(shù)與MALDI-TOF MS陽性有一定的關(guān)系。由此得出，細(xì)菌在MALDI-TOF儀器的最低檢測(cè)濃度與細(xì)菌的種類、數(shù)量應(yīng)該有一定的相關(guān)性。

MALDI-TOF MS鑒定存在差異，可能受以下4個(gè)因素影響：（1）MALDI-TOF MS直接檢測(cè)的尿液樣本經(jīng)離心處理，菌與蛋白混于沉淀中且分布不均，從而導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)不好；（2）菌量多少不一，菌量多的峰圖信號(hào)好，因而檢測(cè)結(jié)果可靠，分值高；而菌量少的峰圖信號(hào)不好，檢測(cè)結(jié)果不好，準(zhǔn)確性不高，至于未檢出的則可能是菌量過少，低于檢出限，且蛋白等雜質(zhì)干擾掩蓋檢測(cè)信號(hào)［9］；（3）革蘭陽性菌較革蘭陰性菌的細(xì)胞壁厚；（4）菌體本身大小有關(guān)不易于雜質(zhì)分離。WANG等［15］研究發(fā)現(xiàn)尿液樣本中2種菌以1∶1或者1∶2混合時(shí)，MALDI-TOF MS直接檢測(cè)時(shí)能夠同時(shí)檢測(cè)到兩種細(xì)菌，而當(dāng)兩者以1∶9比例混合時(shí)，只有優(yōu)勢(shì)菌能夠被檢出。而在本研究中，MALDI-TOF MS直接檢測(cè)混合菌感染的尿液樣本時(shí)，同一樣本中的多種細(xì)菌計(jì)數(shù)在同一數(shù)量級(jí)時(shí)可互相干擾MALDI-TOF MS峰圖導(dǎo)致無法鑒定；當(dāng)非優(yōu)勢(shì)菌數(shù)量比優(yōu)勢(shì)菌低一個(gè)數(shù)量級(jí)，且非優(yōu)勢(shì)菌為表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌、無乳鏈球菌、棒狀桿菌、惡臭假單胞菌等可疑污染菌時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌的MALDI-TOF MS峰圖受非優(yōu)勢(shì)菌的干擾較少，甚至幾乎不受干擾。對(duì)于可能為混合感染的尿標(biāo)本，我們可通過尿培養(yǎng)計(jì)數(shù)鑒別優(yōu)勢(shì)菌落，然后進(jìn)行直接質(zhì)譜鑒定或者進(jìn)一步純培養(yǎng)后再用MALDI-TOF MS鑒定，得出可靠的鑒定結(jié)果。

本研究采用差速離心法富集細(xì)菌，利用MALDITOF MS對(duì)富集后的菌液進(jìn)行快速直接鑒定，并與常規(guī)培養(yǎng)24～48 h后形成的單個(gè)菌落鑒定結(jié)果進(jìn)行比較結(jié)果，表明MALDI-TOF MS技術(shù)可以直接對(duì)原始尿液標(biāo)本中的細(xì)菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，為臨床醫(yī)生提供病原學(xué)診斷依據(jù)，且其成本較低，可在臨床進(jìn)行推廣。應(yīng)用這種快速方法，可省去耗時(shí)的培養(yǎng)過程，臨床醫(yī)生可以提前42 h結(jié)合病人癥狀對(duì)病人進(jìn)行診斷并針對(duì)病原菌予以合適的抗菌治療，提高有效治愈率。MALDI-TOF MS直接檢測(cè)方法還可克服尿培養(yǎng)結(jié)果受前期經(jīng)驗(yàn)性用藥影響的缺陷，幫助臨床醫(yī)生及時(shí)更改治療方案，減少經(jīng)驗(yàn)性用藥，防止耐藥菌的產(chǎn)生［9］。雖然MALDI-TOF MS擁有眾多的優(yōu)點(diǎn)，但其也有一定的局限性，譬如數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)有限，有些種屬無法明確區(qū)分；培養(yǎng)環(huán)境差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)重復(fù)性的影響；儀器昂貴，一次性投入成本高；技術(shù)門檻高，需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)；檢測(cè)方法商品化程度低，難以在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室開展等?；蛟S我們可以通過樣品前處理的標(biāo)準(zhǔn)化、基質(zhì)選擇的規(guī)范化、數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的完善化、開發(fā)實(shí)用的工具軟件，以及與一些實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法相結(jié)合等方法提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率［16］。MALDI-TOF MS在微生物的鑒定以及耐藥性相關(guān)領(lǐng)域中已初露鋒芒，隨著研究的不斷深入和廣泛，相信這一革命性的研究技術(shù)必將給我們帶來巨大的輝煌。