澤漆部分化學(xué)成分研究

趙杰，吳繁榮，李寧，葛金芳，陳飛虎

澤漆（Euphorbia helioscopia L.）是大戟科大戟屬一年生或兩年生草本植物。味辛、苦，性微寒，春季、夏季均可采集，全草曬干后入藥［1］，功能主治為行水消腫；化痰止咳；解毒殺蟲。多年來，國內(nèi)外研究者對澤漆的化學(xué)成分，臨床應(yīng)用和藥理作用進(jìn)行了一系列的研究，揭示該植物主要含有二萜酯類，黃酮類，三萜類，甾醇等化學(xué)成分，且研究表明澤漆具有抗腫瘤，抑菌殺蟲，止咳平喘，抗銀屑病等作用［2-3］。為了闡明其抗銀屑病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對2014年7月至2015年10月澤漆提取物的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)的分離，并觀察得到的單體化合物對角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT的增殖抑制作用，及對細(xì)胞分泌白介素1（interleukin-1，IL-1）和IL-6的影響，為進(jìn)一步開發(fā)澤漆提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材澤漆于夏季6月采自河南省鞏義縣，經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥學(xué)教研室張群林教授鑒定為大戟科大戟屬澤漆Euphorbia helioscopia L。

1.2 儀器與試劑AM-300、400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司，四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)）；Sephadex LH-20（瑞典GEHealthcare Bio-Sciences公司）；MCI小孔樹脂（日本 Mitsubishi Chemical公司）；十八烷基鍵和硅膠（octadecylsilyl，ODS，日本Fujisilysia Chemical公司）；硅膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254硅膠板板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；氘代試劑（美國Sigma-aldrich公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM高糖培養(yǎng)基（美國Hyclone）；CCK-8試劑盒（上海貝博生物）；Elisa試劑盒（美國R&D公司）。

1.3 方法

1.3.1提取分離 取澤漆陰干藥材15 kg，倒入提取罐，加90%的乙醇溶液80 L，蒸汽加熱至60℃，在該溫度條件下浸泡24 h，浸泡液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干溶劑，得到總提物浸膏，并重復(fù)提取4次。合并四次所得總提物浸膏1.14 kg。加水混懸后，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，萃取液濃縮至干，得到石油醚部位（Fra），氯仿部位（Frb），乙酸乙酯部位（Frc）和正丁醇部位（Frd）。石油醚部位Fra（120 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯50∶1～0∶1）梯度洗脫得到8個部分，F(xiàn)ra-1～Fra-8。Fra-6經(jīng)中低壓柱色譜（石油醚-丙酮15∶1）得到6個部分，F(xiàn)ra-6-1～Fra-6-6，F(xiàn)ra-6-1經(jīng)中低壓柱色譜、反復(fù)硅膠柱色譜，重結(jié)晶得到化合物4（19 mg）；Fra-6-2經(jīng)Sephadex LH-20、反復(fù)硅膠柱色譜，得到化合物6（22 mg）。Fra-7經(jīng)中低壓柱色譜（石油醚-乙酸乙酯5∶1）得到5個部分，F(xiàn)ra-7-1～Fra-7-5，其中Fra-7-2經(jīng)Sephadex LH-20（石油醚-氯仿-甲醇5∶5∶1）、反復(fù)硅膠柱層析，最后經(jīng)Sephadex LH-20（純乙醇）純化得一對同分異構(gòu)體2/3（12 mg）。氯仿部位Frb（250 g）經(jīng)硅膠柱色譜（石油醚-丙酮60∶1～0∶1）梯度洗脫得到9個部分，F(xiàn)rb-1～Frb-9。Frb-3經(jīng)硅膠柱（石油醚-乙酸乙酯15∶1～0∶1）得到6個部分，F(xiàn)rb-3-1～Frb-3-6，其中Frb-3-4經(jīng)反復(fù)硅膠柱色譜進(jìn)一步分離純化，最后經(jīng)過Sephadex LH-20（純乙醇）純化，得到化合物1（8 mg）。Frb-3-6經(jīng)Sephadex LH-20（純乙醇）得到4個部分，F(xiàn)rb-3-6-1～Frb-3-6-4，其中Frb-3-6-4采用硅膠柱色譜（石油醚-丙酮8∶1）分離，再經(jīng)過Sephadex LH-20（純乙醇）純化得到化合物5（19 mg）。

1.3.2CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制作用 取對數(shù)期的HaCaT細(xì)胞以4×103個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，邊緣孔用PBS填充，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基不接種細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，空白對照組加等體積的培養(yǎng)基，藥物組加入等體積不同濃度的藥物（藥物終濃度為12.5、25、50、100、200 μmol/L），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)基，藥物組加入等體積不同濃度的藥物，空白對照組加等體積的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h后每孔加入10μL CCK-8，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h后，震蕩數(shù)分鐘后用酶標(biāo)儀測定450 nm處各孔的吸光度值。

1.3.3Elisa法檢測IL-1、IL-6含量 取對數(shù)期的Ha-CaT細(xì)胞，以1×104個/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板中，空白對照組加入等體積的培養(yǎng)基不接種細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育12 h，待細(xì)胞貼壁后，加入10 ng/mL TNF-α溶液刺激，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，藥物組加入等體積不同濃度的藥物（藥物終濃度為6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）其中槲皮素作為陽性對照組。培養(yǎng)24 h后，吸取各孔上清液，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照Elisa試劑盒說明操作。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定化合物1：無色針狀結(jié)晶，溶于氯仿，分子式為C29H50O2。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ 5.60（d，J＝4.9 Hz，1H，H-6），3.85（s，1H，H-7），3.58（m，1H，H-3），0.99（s，3H，H-19），0.93（d，J＝6.5 Hz，3H，H-21），0.84（m，9H，H-26，27，29），0.68（s，3H，H-18）。13C-NMR（151 MHz，CDCl3）δ 146.38（C-5），123.98（C-6），71.49（C-3），65.52（C-7），55.83（C-17），49.55（C-14），45.95（C-24），42.39（C-9），42.28（C-13），42.13（C-4），39.30（C-12），37.64（C-8），37.53（C-10），37.14（C-1），36.25（C-20），34.04（C-22），31.49（C-2），29.24（C-25），28.43（C-16），26.02（C-23），24.45（C-15），23.19（C-28），20.84（C-11），19.95（C-26），19.16（C-27），18.95（C-21），18.40（C-19），12.14（C-29）11.78（C-18）。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道一致，確定該化合物為豆甾-5-烯-3β，7α-二醇。

化合物2：白色粉末，溶于氯仿，分子式為C30H50O2。1HNMR（600MHz，CDCl3）δ 4.92（d，J＝6.7Hz，1H，H-26a），4.83（s，1H，H-26b），4.01（t，J＝6.3Hz，1H，H-24），3.27（m，1H，H-3），1.72（s，3H，H-27），0.96（s，3H，H-18），0.87（m，6H，H-21，28），0.80（s，3H，H-30），0.54（d，J＝3.4Hz，1H，H-19β），0.32（d，J＝3.8Hz，1H，H-19α）。13C-NMR（151MHz，CDCl3）δ 147.88（C-25），111.57（C-26），111.05（C-23），78.97（C-3），76.89（C-24），52.29（C-17），48.93（C-14），48.12（C-8），47.22（C-5），45.39（C-13），40.61（C-4），36.07（C-11），36.04（C-20），35.68（C-12），33.00（C-15），32.09（C-1），32.01（C-22），30.49（C-2），30.04（C-19），28.27（C-7），26.58（C-16），26.18（C-10），26.14（C-11），25.57（C-30），21.25（C-6），20.10（C-9），19.45（C-28），18.45（C-18），17.73（C-17），14.15（C-29）。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報道一致，確定該化合物為24R-環(huán)阿屯-25-烯-3β，24-二醇。

化合物3：白色粉末，溶于氯仿，分子式為C30H50O2。1H-NMR（600MHz，CDCl3）δ 4.92（d，J＝6.7Hz，1H，H-26a），4.83（s，1H，H-26b），4.01（t，J＝6.3Hz，1H，H-24），3.27（m，1H，H-3），1.72（s，3H，H-27），0.96（s，3H，H-18），0.87（m，6H，H-21，28），0.80（s，3H，H-30），0.54（d，J＝3.4Hz，1H，H-19β），0.32（d，J＝3.8Hz，1H，H-19α）。13C-NMR（151MHz，CDCl3）δ 147.57（C-25），111.57（C-26），111.05（C-23），78.97（C-3），76.49（C-24），52.29（C-17），48.93（C-14），48.12（C-8），47.22（C-5），45.39（C-13），40.61（C-4），36.07（C-11），36.04（C-20），35.68（C-12），33.00（C-15），32.01（C-1），31.74（C-22），30.49（C-2），29.84（C-19），28.22（C-7），26.58（C-16），26.18（C-10），26.14（C-11），25.57（C-30），21.25（C-6），20.10（C-9），19.45（C-28），18.44（C-18），17.32（C-17），14.15（C-29）。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報道一致，確定該化合物為24S-環(huán)阿屯-25-烯-3β，24-二醇，與化合物2互為差向異構(gòu)體。

化合物4：白色粉末，溶于甲醇，分子式為C20H34O5。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ 3.48（d，J＝11.4 Hz，1H，H-17a），3.34（d，J＝11.6 Hz，1H，H-17b），3.15（dd，J＝11.3，4.4 Hz，1H，H-3），0.99（s，3H，H-20），0.96（s，3H，H-18），0.78（s，3H，H-19）；13CNMR（151 MHz，CD3OD）δ 79.84（C-3），75.14（C-16），69.61（C-17），56.91（C-5），53.42（C-15），53.19（C-9），40.81（C-7），39.85（C-4），38.94（C-1），38.59（C-8），33.82（C-10），33.10（C-12），28.70（C-18），28.49（C-2），27.59（C-14），24.41（C-13），24.17（C-11），19.60（C-6），16.24（C-19），14.58（C-20）。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報道一致，確定該化合物為阿替生烷-3β，16α，17-三醇。

化合物5：白色結(jié)晶，溶于甲醇，分子式為C21H32O5。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δ 6.64（d，J＝11.6 Hz，1H，H-7），6.06（d，J＝11.0 Hz，1H，H-14），3.98（dd，J＝10.9，2.8 Hz，1H，H-12），3.79（dd，J＝6.4，3.2 Hz，1H，H-3），2.57（m，1H，H-1a），2.29（dd，J＝10.7，3.0 Hz，1H，H-11a），2.13（m，2H，H-1b，H-8），2.00（s，3H，H-16），1.76（s，3H，H-20），1.69（dd，J＝24.6，12.6 Hz，1H，H-11b），1.47（m，3H，H-17），1.18（d，J＝9.0 Hz，3H，H-21），1.09（s，3H，H-19），1.04（d，J＝6.4 Hz，3H，H-18）；13C-NMR（151 MHz，CD3OD）δ 197.00（C-2），171.73（C-15），148.08（C-7），145.91（C-13），133.47（C-6），121.85（C-14），97.03（C-4），82.48（C-3），75.96（C-12），42.05（C-1），41.70（C-8），37.32（C-11），32.37（C-5），30.71（C-10），29.19（C-21），25.73（C-9），21.60（C-16），19.13（C-17），18.58（C-18），16.76（C-19），12.34（C-20）。1H-NMR 和13CNMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道一致，確定該化合物為3，12-dihydroxy-clerodan-13E-en-15-oic acid。

化合物6：白色結(jié)晶，溶于氯仿，分子式為C20H18O5。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ 5.90（d，J＝1.2 Hz，1H，H-7），5.78（d，J＝1.8 Hz，1H，H-1），4.26（s，1H，H-3），4.11（dd，J＝11.7，1.7 Hz，1H，H-8），3.91（s，1H），3.60（s，1H，H-5），2.46（m，1H，H-11），2.24（ddd，J＝15.6，8.4，2.6 Hz，1H，H-12a），1.84（d，J＝1.34 Hz，3H，H-19），1.76（m，1H，H-12b），1.24（s，3H，H-17），1.05（s，3H，H-16），0.95（m，4H，H-14，H-18），0.69（m，1H，H-13）；13C-NMR（101 MHz，CDCl3）δ 207.93（C-9），139.64（C-2），136.39（C-6），129.58（C-1），122.29（C-7），83.42（C-4），79.97（C-3），73.82（C-5），72.99（C-10），64.22（C-20），44.12（C-8），38.42（C-11），31.27（C-12），28.69（C-16），23.91（C-15），23.63（C-13），23.07（C-14），17.98（C-18），15.80（C-19），15.70（C-17）。1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］報道一致，確定該化合物為巨大戟醇。

2.2 化合物對HaCaT增殖的影響利用CCK-8法檢測分離得到的單體化合物對角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT增殖的影響，比較各化合物的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值，以維A酸作為陽性對照藥。結(jié)果顯示，化合物1，4，5，6均有一定的抑制HaCaT細(xì)胞增殖的能力（表1），但均較陽性藥維A酸（52.67μmol/L）弱，其他化合物的增殖抑制作用不明顯。

表1 單體化合物對HaCaT細(xì)胞的抑制效應(yīng)的IC50（n＝3）

2.3 化合物對TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響在細(xì)胞增殖抑制實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行化合物抗炎活性篩選，采用Elisa法測定TNF-α（10ng/mL）刺激的HaCaT細(xì)胞上清中IL-1和IL-6的含量，以槲皮素作為陽性對照藥。結(jié)果顯示，化合物對TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞IL-1分泌量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但能在一定程度上減少IL-6的分泌（表2）。

表2單體化合物對TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞生成IL-1和IL-6生成的抑制作用/（ng/L，±s，n＝3）

表2單體化合物對TNF-α刺激的HaCaT細(xì)胞生成IL-1和IL-6生成的抑制作用/（ng/L，±s，n＝3）

注：與模型組（IL-1：61.36±2.58，IL-6：35.81±1.19）比較，aP＜0.05

IL-1 IL-6化合物1 4 5 6槲皮素單體化合物25μmol/L 33.24±0.92a 34.29±0.40 28.54±0.71a 32.16±1.61a 29.93±0.51a單體化合物100μmol/L 53.64±19.93 49.77±2.89 51.05±3.52 58.34±10.7 52.27±4.18單體化合物50μmol/L 73.42±16.4 50.80±1.77 54.57±5.60 56.40±6.23 57.50±0.64單體化合物25μmol/L 60.34±1.77 52.84±4.66 55.77±2.43 56.77±3.21 57.38±1.45單體化合物100μmol/L 28.81±2.31a 28.93±3.74a 25.78±2.21a 27.71±1.01a 25.86±4.75a單體化合物50μmol/L 29.76±1.11a 30.39±1.19 25.73±1.31a 29.86±1.21a 26.64±4.75a

3 討論

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚疾病，主要是由環(huán)境因素、免疫因素、遺傳因素等相互作用所致［9］，其確切的病因和發(fā)病機制仍未完全闡明。局部浸潤的炎細(xì)胞和表皮角質(zhì)形成細(xì)胞通過分泌的細(xì)胞因子，在銀屑病發(fā)生過程中起重要作用［10］，參與銀屑病炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子主要有有IL-1β，IL-6，IL-21，IL-23，TNF-α，IFN-γ以及一些轉(zhuǎn)錄因子如RORγt，RORɑ，Stat3［11-13］，細(xì)胞因子間相互作用，促表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖，和炎癥細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。研究表明IL-1和IL-6與銀屑病患者的患病程度密切相關(guān)，患者的皮損處和血漿的IL-1和IL-6的水平都較正常人高，且血漿IL-1和IL-6的水平不僅可以反映炎癥的情況，可以作為治療反應(yīng)的一個指標(biāo)［14-16］?？梢奍L-1和IL-6的水平在銀屑病的病程中的重要作用。本實驗中用TNF-α刺激人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，誘導(dǎo)其發(fā)生異常增殖和分泌炎性細(xì)胞因子增多，模擬了銀屑病的體外模型。利用此體外模型我們進(jìn)行澤漆單體化合物對角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖的抑制作用進(jìn)行了實驗，結(jié)果表明，澤漆中的眾多的化學(xué)成分對角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖都有一定的抑制作用，且部分化學(xué)成分可減少炎性細(xì)胞因子IL-6的分泌，具有不同程度的抗銀屑病作用。

然而，澤漆的化學(xué)成分尚未完全闡明，因此還需進(jìn)一步的分離和篩選，得到一些活性更好的化合物，為明確澤漆抗銀屑病藥效提供物質(zhì)基礎(chǔ)。