酸棗仁湯對(duì)睡眠剝奪大鼠視交叉上核生物鐘基因Period 1及Period 2表達(dá)的影響

張付民，李艷兵

失眠為臨床常見(jiàn)的精神系統(tǒng)疾病，常以入睡難、易醒、睡眠淺為主要臨床癥狀［1］，現(xiàn)已對(duì)人們的生活和工作造成了嚴(yán)重影響，迫切需要尋找切實(shí)有效的治療方法。據(jù)統(tǒng)計(jì)［2］，中國(guó)有3億睡眠障礙病人，發(fā)病率高達(dá)38.2%。過(guò)去數(shù)十年研究者主要通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)假說(shuō)和神經(jīng)炎癥假說(shuō)解釋了失眠的發(fā)病機(jī)制，但近幾年研究者發(fā)現(xiàn)下丘腦生物鐘基因失調(diào)與失眠存有相關(guān)性［3］。視交叉上核（Suprachiasmatic nucleus，SCN）為下丘腦中的重要神經(jīng)核團(tuán)，為生物節(jié)律調(diào)節(jié)中樞，能調(diào)節(jié)包括晝夜節(jié)律在內(nèi)的多種生物節(jié)律［4］。SCN能調(diào)節(jié)Period1（Per1）、Period2（Per2）、Clock、Baml1等多種與晝夜節(jié)律相關(guān)的生物鐘基因，其中Per1和Per2的失調(diào)與失眠癥關(guān)系較為密切，為當(dāng)前學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)［5-6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)酸棗仁湯對(duì)于失眠具有較好的療效，其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平和神經(jīng)炎癥有關(guān)，但尚不能確定其是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)生物鐘基因而改善睡眠。為進(jìn)一步探明酸棗仁湯改善睡眠的作用機(jī)制，同時(shí)也為酸棗仁湯臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)支撐，本實(shí)驗(yàn)自2017年1月至2018年1

月通過(guò)腹腔注射PCPA以建立睡眠剝奪模型，并給予模型動(dòng)物酸棗仁湯，應(yīng)用自主活動(dòng)測(cè)試儀記錄大鼠自主活動(dòng)時(shí)間，Real time-PCR、免疫組化和Western blot檢測(cè)SCN中Per1和Per2的基因和蛋白表達(dá)水平，以初步探明酸棗仁湯干預(yù)失眠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物成年健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，40只，體質(zhì)量為200～250 g，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)及合格證號(hào)分別為SCXK（鄂）2015-0018、420006002854238。

1.2 主要藥品及試劑根據(jù)方劑學(xué)［7］中酸棗仁湯藥物組成及配伍計(jì)量確定本研究酸棗仁湯的藥物組成和藥物劑量，即酸棗仁湯由酸棗仁30 g、知母9 g、茯苓6 g、川芎6 g和甘草3 g組成，所有飲片均購(gòu)自湖北省恩施州中心醫(yī)院中藥房。先用8倍于中藥體積的純水浸泡藥物20 min，浸泡后依次使用武火和文火各煎煮藥物20 min，用紗布過(guò)濾藥液，再次向飲片中加6倍于中藥體積的純水，煎煮40 min后濾出藥液，混勻兩次煎取的藥液，最后將藥液置于多級(jí)旋蒸儀中進(jìn)行濃縮，最終制成每毫升含生藥0.486 g的水煎液。褪黑素片，湯臣倍健股份有限公司，批號(hào)20171125D。Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，大連Takara公司，批號(hào)AS4857。SYBR Green qPCR試劑盒，美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)A25780；Trizol，美國(guó)Thermo Fisher公司，批號(hào)15596026。一抗Per1和Per2均為羊抗鼠抗體，德國(guó)默克集團(tuán)，批號(hào)分別為AB5424P、ABN299。HRP標(biāo)記羊抗小鼠抗體二抗，武漢Cusabio公司，批號(hào)CSB-PA644737。

1.3 主要儀器ZZ-6型自主活動(dòng)測(cè)試儀，上海益聯(lián)醫(yī)學(xué)。CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad。Quick Drop型核酸蛋白分析儀，美國(guó)Molecular Devices。Tanon-1600型凝膠圖像成像分析系統(tǒng)，上海天能。

1.4 動(dòng)物分組及給藥適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0生成的隨機(jī)數(shù)字表將實(shí)驗(yàn)大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、褪黑素組和酸棗仁湯組，每組10只，除空白組外，其他3組進(jìn)行腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）混懸液以構(gòu)建睡眠剝奪模型。根據(jù)“人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值”計(jì)算動(dòng)物給藥劑量，褪黑素組給予褪黑素溶液（36 mg·kg-1·d-1，10 mL·kg-1·d-1），酸棗仁湯組給予酸棗仁湯水煎液（4.86 g·kg-1·d-1，10 mL·kg-1·d-1），空白組和模型組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液（10 mL·kg-1·d-1），連續(xù)灌胃2周，1次/天。

1.5 睡眠剝奪模型的建立配置PCPA混懸液（按100 mg/mL溶于0.9%氯化鈉溶液，劑量500 mg/kg），按10 mL/kg的劑量對(duì)模型組、褪黑素組和酸棗仁湯組連續(xù)7 d腹腔注射PCPA混懸液以構(gòu)建睡眠剝奪模型，空白組則連續(xù)7 d腹腔注射等體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.6 動(dòng)物取材及處理自主活動(dòng)實(shí)驗(yàn)完成后取材，從每組采用隨機(jī)數(shù)字表法選取4只大鼠以10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉（4 mL/kg），經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后斷頭取腦，剝離顱骨，冰上分離大鼠下丘腦后鏡下分離SCN，分裝后置液氮速凍，24 h內(nèi)移于-80℃冰箱以用于Western bolt實(shí)驗(yàn)。對(duì)剩余大鼠以同樣方式麻醉，麻醉剪開(kāi)胸腔，以4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，斷頭取腦并分離下丘腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h后進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物處置符合倫理原則。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)實(shí)驗(yàn) 末次灌胃結(jié)束后24 h，將大鼠置于自主活動(dòng)測(cè)試儀敞箱中，同時(shí)啟動(dòng)自主活動(dòng)行為追蹤系統(tǒng)，記錄6 min內(nèi)各組大鼠的活動(dòng)時(shí)間。

1.7.2Real time-PCR檢測(cè)SCN中Per1、Per2表達(dá)

取SCN組織20 mg，加入2 mL Trizol以提取組織中總mRNA；提取后使用核酸蛋白儀檢測(cè)各樣本純度和濃度，當(dāng)OD26/OD280值為1.8～2.0時(shí)則表示可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；按照Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)純度合格的樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄合成步驟及逆轉(zhuǎn)錄條件參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；按照SYBR Green qPCR Master Mix熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)合成后的cDNA進(jìn)行基因擴(kuò)增，擴(kuò)增步驟及擴(kuò)增條件參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。分析Real time-PCR過(guò)程各檢測(cè)樣本的Ct值，并用2-△△Ct表示mRNA相對(duì)表達(dá)水平。通過(guò)Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)Per1、Per2及內(nèi)參β-actin的序列，各基因序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.7.3免疫組化檢測(cè)SCN中Per1、Per2表達(dá) 取出多聚甲醛溶液中的腦組織，進(jìn)行石蠟包埋。包埋后連續(xù)切取5μm厚度的切片，并用二甲苯和梯度乙醇對(duì)切片進(jìn)行脫蠟；將切片平展于3%H2O2中浸泡15 min，使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；向切片表面均勻滴加稀釋后的一抗 Perd1（1∶100）和Perd2（1∶200），室溫孵育1 h；使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；向切片表面均勻滴加稀釋后二的抗（1∶1 000），室溫孵育15 min；使用PBS沖洗切片3 min，洗3次；滴加DAB顯色液，反應(yīng)5 min；最后再次使用梯度乙醇對(duì)切片進(jìn)行水洗、復(fù)染、脫水和透明。顯微鏡下觀察切片，從每天切片中選取5個(gè)高倍（400X）視野，用Image Pro-Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像處理并獲取積分光密度（IOD）值。

1.7.4Western blot檢測(cè)SCN中Per1、Per2表達(dá) 取SCN 20 mg，加含PMSF的蛋白裂解液，組織研磨儀勻漿，以4℃，12 000 r/min離心15 min，取上清，用BCA法測(cè)定各樣本蛋白量；制作10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣40μg后依次電泳和轉(zhuǎn)膜；使用PBS洗片3 min，洗3次；按抗體說(shuō)明書(shū)加入稀釋后一抗Per1（1∶1 000）和一抗Per2（1∶1 000），置4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；使用PBST洗片3 min，洗3次；按抗體說(shuō)明書(shū)加入稀釋后二抗（1∶2 000）；使用PBST洗片3 min，洗3次；向膜表面均勻滴加ECL顯色液，置凝膠圖像成像分析系統(tǒng)獲取各組蛋白條帶，拍照并保存各蛋白條帶。使用Image J計(jì)算各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，均通過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)。組間整體比較采用單因素方差分析，多重比較采用HSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 自主活動(dòng)時(shí)間檢測(cè)結(jié)果空白組活動(dòng)時(shí)間為（377.79±39.55）s，模型組為（478.43±38.89）s，褪黑素組為（394.09±31.27）s，酸棗仁湯組為（412.40±36.24）s，與空白組比較，模型組大鼠活動(dòng)時(shí)間明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠活動(dòng)時(shí)間都有減少（P＜0.01，P＜0.05）。各組大鼠活動(dòng)軌跡圖見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠活動(dòng)軌跡圖：A為空白組；B為模型組；C為褪黑素組；D為酸棗仁湯組

2.2 Real time-PCR檢測(cè)結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達(dá)水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達(dá)水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1 mRNA和Per2 mRNA表達(dá)上升（P＜0.01，P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 酸棗仁湯對(duì)各組大鼠下丘腦SCN中Per1、Per2 mRNA表達(dá)的影響/± s

表2 酸棗仁湯對(duì)各組大鼠下丘腦SCN中Per1、Per2 mRNA表達(dá)的影響/± s

注：多重比較為HSD-q檢驗(yàn)

組別空白組模型組褪黑素組酸棗仁湯組方差分析F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 Per1 mRNA 1.78±0.29 1.26±0.27 1.60±0.21 1.50±0.27 Per2 mRNA 1.50±0.27 1.09±0.25 1.38±0.23 1.34±0.2 3.613 0.025 5.458 0.004

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1和Per2表達(dá)水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1和Per2表達(dá)水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組大鼠SCN中Per1和Per2表達(dá)上升（P＜0.01，P＜0.05），酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1表達(dá)也上升（P＜0.05），Per2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠SCN中Per1、Per2的IOD（累積光密度）值見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠SCN中Per1、Per2的IOD（累積光密度）值

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果空白組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達(dá)水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達(dá)水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白表達(dá)上升（P＜0.01，P＜0.05）。各組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白條帶見(jiàn)圖3，各組大鼠SCN中Per1、Per2灰度值見(jiàn)圖4。

圖3 各組大鼠SCN中Per1和Per2蛋白條帶

圖4 各組大鼠SCN中Per1、Per2灰度值分析

3 討論

酸棗仁湯具有養(yǎng)血滋陰、除煩安神之功，主治“虛勞虛煩不得眠”［8］。該方源自張仲景《金匱要略》，由酸棗仁、川芎、茯苓、知母和炙甘草組成。自古以來(lái)，酸棗仁湯就備受醫(yī)家追捧，為臨床治療失眠的有效方。近年來(lái)，研究人員從不同角度闡述了酸棗仁湯治療失眠的機(jī)制，但其分子機(jī)制尚不明確。近幾年，分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為研究酸棗仁湯治療失眠的分子機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。

煩躁為失眠病人臨床上常見(jiàn)的軀體癥狀之一，睡眠剝奪也會(huì)導(dǎo)致嚙齒類動(dòng)物出現(xiàn)煩躁不安的行為表現(xiàn)，該種行為則常表現(xiàn)為自主活動(dòng)時(shí)間的改變［9］。自主活動(dòng)測(cè)試儀可以觀察大鼠自主活動(dòng)時(shí)間和活動(dòng)軌跡，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪后模型大鼠活動(dòng)時(shí)間明顯增加（P＜0.01），而給與模型動(dòng)物酸棗仁湯后，大鼠自主活動(dòng)時(shí)間明顯減少（P＜0.05），這說(shuō)明成功通過(guò)PCPA構(gòu)建了睡眠剝奪模型，同時(shí)酸棗仁湯可以改善睡眠剝奪模型大鼠的睡眠狀態(tài)。

SCN為生物節(jié)律的起搏器和調(diào)節(jié)中樞，能廣泛調(diào)節(jié)體溫、呼吸、心臟搏動(dòng)、血壓、血糖和睡眠等多種生物節(jié)律［10］。SCN 中可通過(guò)調(diào)節(jié) Per1、Per2、Clock、Bmal1等多種節(jié)律基因而調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒周期，同時(shí)這些基因相互作用共同構(gòu)成調(diào)節(jié)睡眠的反饋環(huán)路，當(dāng)這些節(jié)律基因表達(dá)異常時(shí)則會(huì)引起睡眠障礙［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)［13］，Per1和Per2的基因表達(dá)異常則會(huì)導(dǎo)致晝夜節(jié)律周期改變，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明敲出小鼠Per1和Per1基因則會(huì)導(dǎo)致晝夜節(jié)律逐漸消失?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以Per1、Per2這一正向晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)基因?yàn)檠芯繉?duì)象，以闡明酸棗仁湯調(diào)節(jié)睡眠的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠SCN中Per1、Per2表達(dá)水平較高，造模后，模型組大鼠SCN中Per1、Per2表達(dá)水平下降（P＜0.01），給藥后，褪黑素組和酸棗仁湯組大鼠SCN中Per1、Per2表達(dá)都有不同程度上升（P＜0.01，P＜0.05）。這說(shuō)明睡眠剝奪可以引起大鼠下丘腦SCN中節(jié)律基因Per1、Per2的異常，而酸棗仁湯可以通過(guò)調(diào)節(jié)SCN中Per1、Per2的表達(dá)而達(dá)到防治失眠的療效。

綜合分析，課題組認(rèn)為酸棗仁湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠SCN中Per1、Per2的表達(dá)進(jìn)而改善慢睡眠剝奪大鼠的睡眠狀態(tài)。本研究機(jī)制初步闡明了酸棗仁湯干預(yù)失眠的作用機(jī)制，但其調(diào)節(jié)節(jié)律基因的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外，本研究也為其他中醫(yī)經(jīng)典方的現(xiàn)代化研究提供了一定的借鑒意義。