長期氮添加對亞熱帶森林土壤微生物碳源代謝多樣性的影響

刁 嬋,魯顯楷,田 靜,張永清,莫江明,于貴瑞

1 中國科學(xué)院地理科學(xué)與資源研究所,生態(tài)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)觀測與模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100101 2 山西師范大學(xué),地理科學(xué)學(xué)院,臨汾 041000 3 中國科學(xué)院華南植物園,中國科學(xué)院退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510650

大氣氮(N)沉降是陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的N輸入過程,對維持生態(tài)系統(tǒng)N平衡和生產(chǎn)力至關(guān)重要[1]。然而,人類活動加速了N的輸入過程,據(jù)估計(jì),過去145年(1860—2005),全球N沉降增加了近3倍,并預(yù)計(jì)到2050年將達(dá)到200 Tg N a-1[2]。大量研究證實(shí)大氣N沉降的頻繁輸入會引起土壤呼吸、養(yǎng)分礦化與固定、土壤微生物分解等一系列生態(tài)過程不同程度的變化[3- 4]。而這些變化加速又改變著土壤微生物多樣性以及土壤養(yǎng)分循環(huán)[5- 6]。

土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)重要的組成部分,推動著生物地球化學(xué)循環(huán)與轉(zhuǎn)化,是衡量土壤肥力與健康的關(guān)鍵指標(biāo)[7- 8],因此微生物多樣性對土壤質(zhì)量及生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性具有重要意義。大量研究表明,N沉降會顯著影響土壤微生物量和群落結(jié)構(gòu)[9- 14]。目前研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物量對N沉降具有增加[11]、減少[12- 13]或不變[14]等3種響應(yīng)。微生物功能多樣性信息對于明確不同環(huán)境中微生物群落的作用具有重要意義[15]。其中以BIOLOG微孔板碳源利用為基礎(chǔ)的定量分析描述了微生物對不同種類碳源的利用多樣性,被證明是研究微生物群落代謝功能多樣性的一種簡單和快速的方法[15]。目前研究發(fā)現(xiàn)氮沉降增加會引起土壤微生物對底物的利用模式改變。例如,Johnson等[16]在歐石南叢生的荒地中的研究發(fā)現(xiàn),氮增加造成了微生物對底物的利用率提高了3倍;但在酸性的草地中則相反,土壤微生物對氮增加的響應(yīng)表現(xiàn)為降低對碳源的利用率。Frey等[12]在美國哈佛森林氮添加實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),闊葉林和混交林土壤微生物對底物的利用率與氮增加并沒有明顯的關(guān)系。這些研究的差異性可能和研究區(qū)域,施N時間以及各區(qū)域的土壤植被環(huán)境條件有很大關(guān)系[17- 19]。比如研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物對不同碳源的利用情況對外界環(huán)境變化比較敏感,會受到多種生物和非生物因素的影響[15,20- 23]。例如Blagodatskaya等[20]發(fā)現(xiàn)pH是影響土壤微生物對碳源的利用活性的重要影響因子。陳法霖等[18]通過對南方紅壤丘陵區(qū)的研究發(fā)現(xiàn),針-闊混合凋落物比單一針葉凋落物更有利于提高土壤微生物群落的碳源利用能力。亞熱帶森林作為重要的可再生經(jīng)濟(jì)資源,其對涵養(yǎng)水源、保持水土、溫室氣體預(yù)算和維持生物多樣性方面具有非常重要的貢獻(xiàn)[24]。但是隨著經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展水平的提升,過量的N輸入顯著影響了熱帶和亞熱帶森林的生物地球化學(xué)循環(huán),比如土壤酸化、水體富營養(yǎng)化、林蓄積量下降以及P元素限制加劇等一系列問題[25- 26]。雖然近年來N沉降對亞熱帶和熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)微生物影響的研究越來越多[24,27- 28],但總體上來說研究的時間尺度比溫帶森林短得多。比如,Cusack等[27]以Luquillo試驗(yàn)林中的熱帶雨林和山地森林為例分析了N添加對土壤微生物群落特征的影響。袁穎紅等[25]探討了福建省杉木人工林中土壤微生物功能多樣性對N添加響應(yīng)。因此,加強(qiáng)亞熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)長期N輸入對土壤微生物功能影響的研究,將有助于幫助我們對N、P養(yǎng)分循環(huán)等生態(tài)系統(tǒng)關(guān)鍵過程的調(diào)控,以及對森林生態(tài)系統(tǒng)功能動態(tài)變化的預(yù)測。

本研究以鼎湖山季風(fēng)常綠闊葉林(以下簡稱“季風(fēng)林”)為研究對象,基于已有的長期野外模擬N沉降試驗(yàn)樣地平臺,運(yùn)用Biolog微平板技術(shù)研究了長期N添加對土壤微生物碳源代謝多樣性變化的規(guī)律,同時探討了微生物碳源代謝多樣性與環(huán)境因子之間的相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果可為熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)應(yīng)對全球變化提供重要理論依據(jù),同時對于推動森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展和加強(qiáng)對其管理和功能調(diào)控也具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 樣地概況與設(shè)計(jì)

本研究位于廣東省中部的鼎湖山自然保護(hù)區(qū)(112°33′E,23°10′N),屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。年均溫為21.4 ℃,最冷月(1月)和最熱月(7月)的均溫分別為12.6 ℃和28.0 ℃。年均降雨量為1927 mm,約有3/4集中在3—8月。氣溫及降水具有明顯的季節(jié)性特征。土壤類型為由泥盆紀(jì)厚層變質(zhì)砂巖、砂頁巖發(fā)育而成的不同深度的氧化土(土壤深度超過60 cm)[29- 30]。季風(fēng)林為本地典型的地帶性植被,其喬木層的主要物種有錐栗(Castanopsischinesis)、荷木(Schimasuperba)、厚殼桂(Cryptocaryachinensis)、黃果厚殼桂(Cryptocaryaconcinna)、華潤(Machiluschinesis)等;而灌木層則以柏拉木(Blastuscochinchinensis)、九節(jié)(Psychotriarubra)、光葉山黃皮(Randiacanthioides)等可耐陰植物類型占比較高[30- 31]。建立樣地之初,各小區(qū)植被物種組成不存在顯著差異。

該研究區(qū)域從1990年以來氮沉降問題日趨嚴(yán)重(>30 kg N ha-1a-1),根據(jù)觀測,2009—2010年,該區(qū)域全年N濕沉降量和干沉降量分別為34.4 kg N hm-2a-1和14.2 kg N hm-2a-1[32]。結(jié)合本地氮沉降情況,本研究設(shè)計(jì)了4個N水平處理[29],分別包括：對照(Control:0 g m-2a-1)、低氮(Low N: 5 g N m-2a-1)、中氮(Mediate N:10 g N m-2a-1)、高氮(High N:15 g N m-2a-1)。自2003年7月開始,以NH4NO3為氮源,每月月初以溶液的形式噴灑到樣地地面,全年平均噴施,并在整個研究期間持續(xù)進(jìn)行。根據(jù)氮處理水平的需要,將每個樣方每次所需要噴施的NH4NO3溶解在20 L水中, 對照(CK)、低氮(LN)、中氮(MN)、高氮(HN)四個處理溶液的濃度分別為0、0.3、0.6和0.9 mol N/L。然后以背式噴霧器人工來回均勻噴灑在林地上,噴灑高度1.5 m左右(為了確保肥料的均勻分布,在每個地塊上都有兩條路徑)。對照樣方則噴灑等量的水。

1.2 土壤樣品的采集與處理

2015年10月在季風(fēng)林中每個樣方內(nèi)進(jìn)行采樣(12個樣方)。每個樣方內(nèi)利用“五點(diǎn)混合法”用土鉆(直徑4 cm)采集0—10 cm的土壤,然后4 ℃低溫保存運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。將用于測定土壤無機(jī)氮和可溶性有機(jī)碳(DOC)浸提以及Biolog實(shí)驗(yàn)的土壤4 ℃保存,并于一周內(nèi)完成測定;其余土樣風(fēng)干并用于土壤理化性質(zhì)的測定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1土壤理化性質(zhì)的測定

1.3.2土壤微生物碳源利用測定分析

土壤微生物群落碳代謝多樣性采用Biolog方法進(jìn)行[34]：在超凈工作臺中,稱取10 g鮮土置于無菌錐形瓶中,加入90 mL 85%滅菌NaCl溶液,封口后,振蕩30 min(250 r/min)。靜置10 min后取5mL上清液,將溶液稀釋1000倍。最后用8通道移液器將上述稀釋液加到Biolog-ECO微平板(Biolog, Hayward, USA)的每個孔中,每孔150 μL。將接種好的Biolog-ECO微平板于25 ℃條件下培養(yǎng),分別于0、12、24、36、48、60、72、96、120、144、168 h在微孔板讀數(shù)儀(Biolog, Inc, USA)上讀取590nm波長下的吸光值。Biolog-Eco平板測定的每孔顏色平均變化率(average well color development,AWCD),用來表示微生物群落利用單一碳源的能力即微生物的整體代謝活性,計(jì)算公式如下[35]：

式中,C為有碳源的每個孔的光密度值,R為對照孔的光密度值,n為碳源的數(shù)目,Biolog-Eco板的C源數(shù)目為31[36]。

本研究采用培養(yǎng)72 h光密度值分析土壤微生物群落功能多樣性,計(jì)算公式如下[37]：

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)

豐富度指數(shù)S=被利用碳源的總數(shù)目(C-R>0.2的孔數(shù))

式中,Pi=(C-R)/∑(C-R)表示第i個孔的相對吸光值與整個微平板相對吸光值總和的比值。

圖1 不同濃度N處理下土壤微生物群落AWCD值隨培養(yǎng)時間的變化Fig.1 Changes of AWCD of soil microorganism under different nitrogen additions with induction timeCK: 對照;LN: 低氮處理; MN: 中氮處理; HN:高氮處理

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

不同處理下土壤微生物功能多樣性指數(shù)和碳源利用強(qiáng)度的差異用LSD檢驗(yàn)確定(SPSS22.0)。在Canoco for Windows 5.0軟件中,利用培養(yǎng)96 h的AWCD數(shù)據(jù)對不同N處理下土壤微生物碳源代謝多樣性進(jìn)行主成分分析(PCA)。用非參數(shù)的多元方差分析(PERMANOVA)檢驗(yàn)不同N水平處理下土壤微生物碳源代謝多樣性的差異。對季風(fēng)林中環(huán)境因子和培養(yǎng)96 h的AWCD數(shù)據(jù)進(jìn)行典型對應(yīng)分析(CCA)和方差分解分析(VPA),探討環(huán)境因子對微生物碳源代謝多樣性的影響。其中CCA和VPA通過R語言“vegan”程序包進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 長期不同N量添加對土壤微生物碳源代謝活性影響

由圖1所知,隨著培養(yǎng)時間的延長,不同N水平處理下的平均吸光值(AWCD)值均呈現(xiàn)出逐漸增加的變化趨勢,并且曲線為平滑的“S”型曲線。0—24 h,土壤微生物的AWCD值緩慢變化;24—96 h AWCD值快速增長,隨后增長變緩慢,在96 h后趨于平緩。在整個培養(yǎng)過程中,季風(fēng)林中AWCD值的大小順序?yàn)椋篊K>LN>MN ≈ HN。對整個培養(yǎng)過程做重復(fù)性方差分析發(fā)現(xiàn)：與CK相比,長期MN(P=0.024)和HN(P=0.015)處理顯著降低了土壤微生物碳源代謝活性(AWCD)。

2.2 長期不同N量添加對不同碳源利用強(qiáng)度以及多樣性影響

Biolog-Eco板中含有31種碳源,包括糖類(7種)、羧酸類(9種)、氨基酸類(6種)、胺類(2種)、聚合物類(4種)、酚酸類(3種)。不同N水平添加處理下土壤微生物群落對同一類型碳源的利用強(qiáng)度存在明顯差異。具體表現(xiàn)在：隨著N添加水平的提高,微生物對糖類、羧酸、氨基酸、胺類和酚酸類的利用率顯著降低;尤其是HN處理最為明顯,與CK(對照)相比分別降低了35.3%、48.9%、41.6%、80.2%和32.8%。不同N水平處理沒有影響聚合物類的利用。

為了進(jìn)一步確定N添加對土壤微生物碳源利用率的影響,本文計(jì)算了Shannon多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和均勻度指數(shù)(表1)。與CK相比,長期MN和HN處理顯著降低了碳源豐富度指數(shù)以及Shannon多樣性指數(shù)。而均勻度指數(shù)結(jié)果表明,MN和HN顯著高于CK。

圖2 季風(fēng)林中不同濃度N處理下土壤微生物碳源利用強(qiáng)度Fig.2 Utilization intensities of carbon sources under different nitrogen additions柱形上方不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P< 0.05)

林型Forest type處理TreatmentShannon多樣性指數(shù)Shannon-Wiener index豐富度指數(shù)Richness index均勻度指數(shù)Evenness季風(fēng)林CK3.17±0.02a22±2.08a1.03±0.04bMonsoon forestLN 3.15±0.02a 19±0.88ac 1.06±0.01abMN3.02±0.12b16±1.17b1.10±0.02aHN3.03±0.06b 18±2.86bc1.09±0.02a

同列不同字母表示差異顯著(P< 0.05)

2.3 分析長期不同N量添加對土壤微生物碳源利用主成分分析

圖3 不同濃度N處理下土壤微生物群落對碳源利用多樣性的主成分分析Fig.3 Principal components analysis (PCA) of soil microbial carbon source utilization diversity under different nitrogen additions

利用培養(yǎng)96 h的AWCD數(shù)據(jù),對31種碳源利用情況進(jìn)行主成分分析(圖3)。主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的方差貢獻(xiàn)率分別為63.1%和15.1%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為78.2%,說明PC1和PC2是微生物群落碳源利用變異的主要來源,可以解釋變異的大部分信息。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明不同N水平添加對土壤微生物群落在碳源利用上有明顯的分異(圖3,PERMANOVA檢驗(yàn),P=0.001)。

2.4 長期不同N量添加下土壤微生物碳源利用的主要環(huán)境影響因子

圖4 不同濃度N處理下土壤微生物群落碳源利用環(huán)境因子影響的分類變異分析Fig.4 Variation partitioning analysis (VPA) of carbon source utilization diversity and environmental factors under different nitrogen additions

為了更好的明確影響土壤微生物碳源利用的主要顯著影響環(huán)境因子,將與之相關(guān)的10個環(huán)境因子進(jìn)行了典型對應(yīng)分析(CCA)(圖5)。檢驗(yàn)結(jié)果如下：引起不同N添加下土壤微生物碳源利用顯著差異最主要的土壤因子是土壤pH(F=4.78,P=0.009)。植被因子(植被豐富度和凋落物量)與土壤微生物碳源利用差異無顯著相關(guān)性。

圖5 不同濃度N處理下土壤微生物群落碳源利用多樣性與環(huán)境因子的典型對應(yīng)分析Fig.5 Canonical correspondence analysis (CCA) of carbon source utilization and environmental factors under different nitrogen additions

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)不同N水平添加顯著影響了土壤微生物對不同碳源的利用能力以及碳源利用多樣性。一般來說,土壤微生物碳源利用率和AWCD值之間成正比例關(guān)系,即AWCD可反映土壤微生物活性對碳源利用能力或利用強(qiáng)度[24,38]。本研究中,季風(fēng)林中土壤微生物碳源利用強(qiáng)度隨N添加量的增加而顯著降低,和Compton等[39]在Harvard森林長期氮輸入實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們還發(fā)現(xiàn)糖類、羧酸、氨基酸、胺類和酚酸類碳源的利用隨著施N水平的提高顯著下降(圖2)。長期高劑量N添加顯著降低土壤微生物碳源利用率的原因可能在于：一方面,長期施用N肥,不僅會降低微生物生物量[40- 41],而且對土壤微生物活性產(chǎn)生一定的負(fù)面影響[42],進(jìn)而影響土壤微生物對底物的利用率;同時季風(fēng)林樣地為相對富N環(huán)境[32],土壤中N元素基本上可能已經(jīng)達(dá)到了飽和的臨界值,如果繼續(xù)施N肥,也會對微生物對碳源利用率產(chǎn)生一定的抑制作用[43]。Deforest等[42]在北方硬葉闊葉林氮沉降樣地中的試驗(yàn)以及劉蔚秋等[44]在南亞熱帶林內(nèi)生境中微生物底物利用能力影響的研究中也得出了類似的結(jié)論。但是也有研究發(fā)現(xiàn)施用N肥會提高微生物碳源利用多樣性或者無影響,比如Grayston等[45]在英國高山草地中發(fā)現(xiàn),N增加提高了土壤微生物的碳源利用效率。Zhou等[14]則在對位于中國西北部的古爾班通古特沙漠的研究表明,土壤微生物對底物的利用率與N增加并沒有明顯關(guān)系。這些研究的差異可能主要與研究區(qū)域、施氮時間、研究時期等有關(guān)。

多樣性指數(shù)從本質(zhì)上來說,一方面可以反映土壤微生物群落功能多樣性,另一方面也是評價土壤微生物群落利用碳源程度的重要指標(biāo),該值和微生物群落的多樣性、碳源利用效率之間有著正相關(guān)關(guān)系[46]。不同的碳源利用多樣性指數(shù)又可真實(shí)的反映土壤微生物群落功能多樣性的不同側(cè)面。本研究表明施N對土壤微生物的功能活性產(chǎn)生了顯著的影響,主要體現(xiàn)在Shannon指數(shù)和豐富度指數(shù)均隨著N濃度的增加均表現(xiàn)出降低的趨勢(表2)。部分研究也發(fā)現(xiàn)LN處理在不同程度上增加了均勻度和Shannon指數(shù),而HN處理下則出現(xiàn)降低[22,47]。土壤微生物對土壤生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境的改變反映非常的敏感[48]。不同濃度N添加處理可以通過直接或間接影響土壤理化性質(zhì)、物質(zhì)轉(zhuǎn)換以及營養(yǎng)物質(zhì)的有效性,使土壤微生物生存的微環(huán)境發(fā)生改變,進(jìn)而導(dǎo)致土壤微生物結(jié)構(gòu)及其功能多樣性發(fā)生變化。MN和HN處理下土壤微生物功能多樣性顯著低于對照處理可能是多種環(huán)境因子共同作用的結(jié)果,其中主要包括土壤因子和氣候因子的多重作用以及兩者之間的交互影響(圖4、5)。

土壤pH(P<0.01)對土壤微生物碳源代謝產(chǎn)生極其顯著的影響的主要原因可能是施N量的增加會直接導(dǎo)致土壤pH的下降,進(jìn)而對土壤中微生物群落的群落結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生顯著影響。劉蔚秋等[44]通過對南亞熱帶林內(nèi)生境中土壤微生物對模擬大氣氮沉降的響應(yīng)研究,以及Smolander等[49]、Aerts等[50]和Wallander等[51]的研究表明,持續(xù)的N增加使土壤含N量處于過飽和狀態(tài),由此引起的土壤酸化、板結(jié)和毒效應(yīng)可能是微生物功能改變、活性降低的重要原因。其他研究中曾發(fā)現(xiàn)類似的研究現(xiàn)象[52-54]。植物因素對土壤微生物碳源利用效率變異的解釋程度較小,這可能與該樣地林齡較長而處于緩慢生長期等因素有關(guān)。

4 結(jié)論

長期不同N量添加顯著降低了土壤微生物碳源代謝活性,同時改變了土壤微生物對底物(不同碳源)的利用模式,進(jìn)而引起微生物碳源利用多樣性發(fā)生相應(yīng)的改變。土壤pH因子是長期不同N水平處理下微生物碳源利用變異的主要影響因素。該研究結(jié)果可為熱帶森林生態(tài)系統(tǒng)生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)功能改變對全球變化響應(yīng)提供了理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐;同時對于推動森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展和加強(qiáng)對其管理和功能調(diào)控也具有重要的科學(xué)意義。