巨菌草內(nèi)生細(xì)菌多樣性及其促生特性

鄧振山，李買平，郝 雷，陳凱凱，李 靜，劉玉珍，張寶寶，齊向英

(1. 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000； 2. 延安市寶塔區(qū)畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心，陜西 延安 716000)

巨菌草(Pennisetumsp.)系禾本科(Poaceae)狼尾草屬(Pennisetum)多年生直立叢生型植物[1]，適宜在熱帶、亞熱帶、溫帶生長(zhǎng)，可以作為栽培食用菌和藥用菌培養(yǎng)基質(zhì)的草本植物。巨菌草為典型的C4植物，其生物量高，約為40 t· ha-1·y-1，粗蛋白含量約為15%～22%，是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牧草，具有生長(zhǎng)快，粗蛋白和糖分含量高，抗逆性強(qiáng)，管理粗放和適種于各種類型的土壤等特點(diǎn)[2]。

植物內(nèi)生細(xì)菌是一類存在于植物組織內(nèi)，但不引起宿主植物病害癥狀的微生物[4]。內(nèi)生細(xì)菌廣泛存在于多種健康植物中，通過(guò)與植物相互作用，可對(duì)宿主植物的生長(zhǎng)及抗逆能力起到積極作用[5]。目前為止，巨菌草已經(jīng)用于平茹(Pleurotusostreatus)和黑木耳(Auricularia?auricula)等多種食藥用菌的栽培[6]，但對(duì)巨菌草的研究大多集中在抗寒、抗堿、抗鹽、抗旱等方面[1-3]。

自從在延安市實(shí)施“退耕還林還草工程”以來(lái)，采取封山育林措施，導(dǎo)致飼草短缺成為制約當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)發(fā)展的瓶頸。因此，為解決延安市畜牧業(yè)發(fā)展中飼草短缺、成本高及“治溝造地工程”土壤改良問(wèn)題，2012年延安大學(xué)科研人員從國(guó)家菌草工程研究中心成功引種巨菌草至延安市，經(jīng)過(guò)幾年的試驗(yàn)，已成功推廣3萬(wàn)余畝，促進(jìn)了當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)的發(fā)展。但目前巨菌草相關(guān)的基礎(chǔ)理論研究仍處于起步階段，尤其是關(guān)于巨菌草內(nèi)生菌的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本文以巨菌草為研究對(duì)象，從中篩選出具促生作用的內(nèi)生細(xì)菌，并通過(guò)16S rDNA鑒定促生菌株的分類地位，以期為植物內(nèi)生促生菌的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)，也為巨菌草微生物菌肥的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及處理

2016年9月在陜西省延安市寶塔區(qū)萬(wàn)花鄉(xiāng)(36°63′97″ N，109°32′07″ E)、福建省福州市倉(cāng)山區(qū)倉(cāng)山鎮(zhèn)(26°08′55″ N，119°28′22″ E)、新疆昌吉市榆樹(shù)溝鎮(zhèn)(44°04′21″ N，87°18′19″ E)、內(nèi)蒙古巴彥淖爾(沙地)烏拉特后旗巴音寶力格鎮(zhèn)(40°13′55″ N，107°05′05″ E)、內(nèi)蒙古巴彥淖爾(鹽堿地)臨河區(qū)小召鎮(zhèn)(40°30′19″ N，107°02′98″ E)5個(gè)生境采集完整巨菌草植株體，從上述樣地采集的樣品依次分別編號(hào)為SX，F(xiàn)J，XJ，NS，NY，采集的巨菌草植株生長(zhǎng)性狀良好、無(wú)病害癥狀，采集后用無(wú)菌袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4 ℃下保存?zhèn)溆茫? d內(nèi)處理完。各樣本采樣地的具體信息如表1所示。

表1 各樣本采集點(diǎn)地理位置和氣候信息

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato Dextrose Agar,PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于培養(yǎng)酵母菌、霉菌、蘑菇等真菌。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2。用于培養(yǎng)細(xì)菌。

察氏培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO4·3H2O 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于分離和培養(yǎng)真菌。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar,NA)培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。用于培養(yǎng)細(xì)菌。

高氏I號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，KNO31 g，NaCl 0.5 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。用來(lái)培養(yǎng)和觀察放線菌形態(tài)特征。

無(wú)機(jī)磷基本培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，KCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，MgCl2·6H2O 5 g，Ca3(PO4)25 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于溶磷能力的定性及定量測(cè)定。

阿須貝氏(Ashby)無(wú)氮培養(yǎng)基：甘露醇10 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaSO4·2H2O 0.2 g，KH2PO40.2 g，NaCl 0.2 g，CaCO35 g，瓊脂15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。用于固氮菌的培養(yǎng)。

1.3 巨菌草內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化

采用組織塊分離法和劃線分離法對(duì)菌草植株體中的內(nèi)生菌進(jìn)行篩選，在超凈工作臺(tái)中對(duì)材料表面進(jìn)行消毒。選擇新鮮、健康菌草根、莖、葉，首先去掉表面的泥土等附著物，然后用自來(lái)水沖洗干凈，再用無(wú)菌水沖洗1次；于95%酒精中浸泡3～5 min后無(wú)菌水沖洗3～4次，然后轉(zhuǎn)入含有效氯為5%的次氯酸鈉溶液中浸泡3～8 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，最后用70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗4～5次，晾干備用；在無(wú)菌狀態(tài)下將材料切成0.2 cm×0.2 cm的小塊，每平板接2～4個(gè)植物組織塊，于28℃恒溫靜置培養(yǎng)3～5 d。待培養(yǎng)基中有可見(jiàn)菌落時(shí)，挑取周圍菌落移入相應(yīng)培養(yǎng)基純化，并進(jìn)行菌落形態(tài)描述和編號(hào)，置于4℃冰箱中備用。將最后1次沖洗的無(wú)菌水涂布于培養(yǎng)基上作為對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，檢驗(yàn)消毒的效果[7-8]。采用多種培養(yǎng)基對(duì)巨菌草植株體進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌分離，挑取分離平板上的單菌落進(jìn)行多次劃線純化，直至分離出單菌落，記錄單菌落的形態(tài)特征、編號(hào)、斜面保存。

1.4 菌株促生特性分析

產(chǎn)IAA能力測(cè)定 將待測(cè)菌株接種于加入色氨酸(1 g·L-1)的NA液體培養(yǎng)基，28 ℃ 180 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)3 d，于4 ℃下12 000 rpm離心后取100 μL上清液加入96孔板中，加入100 μL Salkowski，s試劑混勻，室溫下避光顯色30 min，然后進(jìn)行觀察。能夠產(chǎn)生IAA的菌株菌懸液上清與Salkowski，s試劑混合會(huì)呈現(xiàn)紅色或者粉紅色，而色氨酸是黃色或者無(wú)顏色反應(yīng)[9]，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的IAA濃度[10-11]。

溶磷能力測(cè)定 將篩選得到的不同生境巨菌草內(nèi)生細(xì)菌接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，培養(yǎng)36 h后，將內(nèi)生細(xì)菌分別點(diǎn)接于NBRIP平板中，28℃恒溫暗培養(yǎng)7～10 d，檢查內(nèi)生細(xì)菌的菌落周圍有沒(méi)有透明溶磷圈。如果出現(xiàn)透明溶磷圈，則說(shuō)明該菌株具有溶磷能力，溶磷圈的大小表示菌株溶磷能力大小[12]。并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌液中的磷濃度[13-14]。

潛在固氮能力檢測(cè) 將待測(cè)菌株接種到NA液體培養(yǎng)基，28 ℃下180 r·min-1搖床震蕩培養(yǎng)36 h后，以10%的接種量把活化好的菌懸液(2.0×109個(gè)·mL-1)接種到Ashby液體培養(yǎng)基中，對(duì)照接種無(wú)菌水，28 ℃靜置培養(yǎng)，7 d后對(duì)比處理組與對(duì)照組的渾濁情況，明顯渾濁為陽(yáng)性，即為有固氮活性[15-16]。

產(chǎn)鐵載體能力的測(cè)定 將上述分離到的內(nèi)生細(xì)菌接種到CAS檢測(cè)培養(yǎng)基，28 ℃下160 r·min-1恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察檢測(cè)培養(yǎng)基的顏色變化并記錄。如果檢測(cè)培養(yǎng)基的顏色由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色，則就說(shuō)明該菌株具有產(chǎn)鐵載體的能力[17-19]。

抑制病原真菌活性試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法測(cè)定上述分離得到的內(nèi)生細(xì)菌的抑菌活性。選取番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.Lycopersic)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp. cucumebriumOwen)、玉米大斑病菌(Exserohilumturcicum)作為指示菌。從斜面挑取純化的內(nèi)生細(xì)菌菌種和3株供試指示菌分別接種于PDA平板上，待生長(zhǎng)旺盛后，用已滅菌的打孔器(r=0.5 cm)在該平板上打孔，將待測(cè)的內(nèi)生細(xì)菌接種到PDA固體培養(yǎng)基的四周，在中間接種指示菌，以只中間接種指示菌為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，觀察各菌株對(duì)指示菌的抑制作用，待抑菌圈不再變化時(shí)，用刻度尺測(cè)量抑菌圈大小并記錄[20]。

1.5 內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.5.116S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增 采用菌落PCR方法[21]擴(kuò)增促生菌株的16S rDNA，采用細(xì)菌通用引物，序列如下：P1(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGC-T-3’)和P6(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)，若這對(duì)引物無(wú)法擴(kuò)增，則用引物：8F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Es Taq Masterase (25 μL)、引物(10 μmol·L-1)各1 μL、模板DNA 1 μL，最后補(bǔ)充去離子水至50 μL；反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃變性，30 s；55 ℃退火，30 s；72 ℃延伸，30 s，30 個(gè)循環(huán)；終延伸：72 ℃，5 min[4]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，目標(biāo)條帶約1 500 bp。

1.5.216S rDNA基因序列測(cè)定、序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 將16S rDNA基因擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序引物與PCR擴(kuò)增所用引物相同。將獲得的16S rDNA基因序列提交到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information,NCBI)的GenBank基因庫(kù)，進(jìn)行BLAST比對(duì)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行同源性分析，運(yùn)用MEGA 6.06 軟件，選用鄰接法(Neighbour-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[22]，分析菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征，獲得GenBank登錄號(hào)。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨菌草內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

從5個(gè)樣地的巨菌草樣品中共分離得到187株內(nèi)生細(xì)菌：其中陜西51株，占總分離菌株數(shù)的27.27%；福建43株，占總分離菌株數(shù)的22.99%；新疆34株，占總分離菌株數(shù)的18.18%；內(nèi)蒙古(沙地)28株，占總分離菌株數(shù)的14.97%；內(nèi)蒙古(鹽堿地)32株，占總分離菌株數(shù)的17.11%。

2.2 菌株促生特性結(jié)果分析

2.2.1IAA產(chǎn)生能力測(cè)定結(jié)果 本試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明分離自巨菌草植株的187株內(nèi)生細(xì)菌中86株具有分泌IAA的能力，占全部菌株的46%。定量測(cè)定結(jié)果表明，各菌株產(chǎn)IAA的量不同，其中菌株XJ-4產(chǎn)IAA的能力最強(qiáng)，分泌的IAA濃度為30.13 mg·L-1。分別測(cè)定促生能力后，從中篩選出促生效果好的22株代表菌株，其具體的促生特性如表2所示。

表2 巨菌草內(nèi)生細(xì)菌的促生功能特性

續(xù)表2

注：表中數(shù)據(jù)為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差。抑菌圈直徑:“+”表示d≤10 mm;“++”表示10 mm 30 mm;“-”表示無(wú)抗性

Note:Values in the table indicated mean±SE. Antibiotic circle diameter:“+” means d≦10 mm;“++” means 10 mm 30 mm;“-” means none inhibitory activity

2.2.2溶磷能力測(cè)定結(jié)果 經(jīng)過(guò)溶解磷酸鈣能力的定性檢測(cè)，共有47株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌具有溶磷能力，占全部菌株的25%。定量測(cè)定結(jié)果表明，各菌株溶磷量不同，其中菌株FJ-23,FJ-15溶磷量最高，分別為7.10 mg·L-1,7.35 mg·L-1(表2)。

2.2.3潛在固氮能力測(cè)定結(jié)果 本研究中187株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌在Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況顯示，共有128株，64%的巨菌草內(nèi)生細(xì)菌可以正常生長(zhǎng)。22株內(nèi)生細(xì)菌中有17株能在培養(yǎng)基液面或者液面以下出現(xiàn)菌膜，顯示這些巨菌草內(nèi)生細(xì)菌具有潛在的固氮能力(表2)。

2.2.4產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定結(jié)果 觀察各內(nèi)生菌株在CAS檢測(cè)培養(yǎng)基中的顯色反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果表明有34株內(nèi)生細(xì)菌在檢測(cè)培養(yǎng)基中的顯色液反應(yīng)為粉紅色，說(shuō)明這些內(nèi)生細(xì)菌具有產(chǎn)鐵載體的能力(見(jiàn)圖1)。

圖1 部分菌株進(jìn)行產(chǎn)鐵載體定性測(cè)定的結(jié)果

2.2.5抑制病原真菌活性試驗(yàn) 結(jié)果表明，大部分內(nèi)生細(xì)菌對(duì)1種或者多種指示菌具有抑制作用，但是也有一部分內(nèi)生細(xì)菌對(duì)3種指示菌都沒(méi)有抑制作用，其中菌株SX-21，SX-30，SX-1，NY-10顯示了出對(duì)3種指示菌都具有抑菌活性(見(jiàn)圖2和表1)。

圖2 部分代表菌株抑制病原菌能力測(cè)定結(jié)果

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

通過(guò)對(duì)菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，各菌株的16S rDNA基因序列已提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，其序列號(hào)如表3所示。經(jīng)BLAST分析，各菌株與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近種屬的菌株16S rDNA基因相似性如表3所示。

表3 巨菌草內(nèi)生代表菌株和參比菌株的16S rDNA基因序列相似性比較

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌和相關(guān)模式菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)，并采用MEGA 6.06的Neighbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示：這23株具促生特性的巨菌草內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的相關(guān)菌株16S rDNA基因序列的相似性均達(dá)到99.01%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)顯示，23株菌株分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)的系統(tǒng)發(fā)育分支上，說(shuō)明巨菌草中具促生特性的內(nèi)生細(xì)菌存在豐富的種屬多樣性。

分支I為芽孢桿菌屬，共有16株菌，菌株SX-21，SX-24，SX-30，F(xiàn)J-6和FJ-7的最相似菌株均為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)，同源性分別為99.59%，99.86%，99.32%，99.32%和100%，其中菌株FJ-7的同源性達(dá)100%，說(shuō)明FJ-7與蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus)為同一種菌種，菌株FJ-23，XJ-19，NS-5，NY-16，NY-20的最相似菌株均為巨大芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)，同源性分別為99.66%，99.73%，99.66%，99.66%和99.52%，菌株NY-10，XJ-14，SX-1的最相似菌株均為維氏芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)，同源性分別為99.79%，99.57%和99.79%，菌株SX-2，F(xiàn)J-19的最相似菌株均為維德曼芽孢桿菌(Bacilluswiedmannii)，同源性分別為99.32%,99.18%。

圖3 菌株16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

分支Ⅱ?yàn)楦鼍鷮?，由菌株NY-7和其它參比菌株組成。菌株NY-7的最相似菌株為放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)，同源性為99.64%。

分支Ⅲ為寡養(yǎng)單胞菌屬，有2株菌。菌株NS-8、XJ-12的最相似菌株分別為Stenotrophomonastumulicola和Stenotrophomonaspavanii，同源性分別為99.59%，99.01%。

分支IV為假單胞菌屬，由菌株NS-18和其它參比菌株組成。菌株NS-18的最相似菌株為湖南假單胞菌(Pseudomonashunanensis)，同源性為99.36%。

分支V為不動(dòng)桿菌屬，由菌株XJ-16和其它參比菌株組成。菌株XJ-16的最相似菌株為魯氏不動(dòng)桿菌(Acinetobacterlwoffii)，同源性為99.45%。

分支VI為腸桿菌屬，有2株菌。菌株XJ-4,SX-12的最相似菌株分別為生癌腸桿菌(Enterobactercancerogenus)、非脫羧勒克菌(Leclerciaadecarboxylata)，同源性分別為99.79%，99.65%。

3 討論

本文以不同生境的巨菌草植株體為材料，經(jīng)篩選共得到187株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌，內(nèi)生細(xì)菌會(huì)對(duì)植物體產(chǎn)生不同的有益效應(yīng)，包括促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制病原菌、溶磷、固氮和提高抗逆能力等[9-11]。本文通過(guò)產(chǎn)IAA能力、溶磷能力、固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力以及抑制病原菌活性測(cè)定，得出分離自巨菌草植株體的187株內(nèi)生細(xì)菌中有86株具有分泌IAA的能力，占全部菌株的46%；有47株具有溶磷能力，占全部菌株的25%；共有128株，占全部菌株64%的巨菌草內(nèi)生細(xì)菌都具有潛在的固氮能力。植物內(nèi)生固氮細(xì)菌通過(guò)固氮作用，較根外環(huán)境更有利于形成高效固氮體系，進(jìn)而促進(jìn)作物的生長(zhǎng)及產(chǎn)量的提高，促進(jìn)宿主對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，在農(nóng)業(yè)中具有重要的應(yīng)用潛力。所以，固氮資源的發(fā)掘和利用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用上具有非常重要的意義，目前已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[23]。林標(biāo)聲等[24]采用Ashby和Nfb無(wú)氮培養(yǎng)基，從巨菌草成熟期根部分離得到 1株具有高效固氮性能的內(nèi)生固氮菌(Klebsiellavariicola)。本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，經(jīng)篩選，得到1株內(nèi)生固氮細(xì)菌放射根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)。本文對(duì)部分促生菌株的16S rDNA基因進(jìn)行了測(cè)序比對(duì)，23株菌株分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、產(chǎn)氣腸桿菌屬(Enterobacter)的系統(tǒng)發(fā)育分支上，說(shuō)明巨菌草中具促生特性的內(nèi)生細(xì)菌存在豐富的種屬多樣性。賈雨雷等[25]首次采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì) 6個(gè)不同地區(qū)巨菌草內(nèi)生固氮菌群落及其多樣性進(jìn)行研究，共獲得 64 122 條有效序列，經(jīng)分析歸屬于 6個(gè)門，10 個(gè)綱，17 個(gè)目，24 個(gè)科,33 個(gè)屬和 39 個(gè)種，以變形菌門和藍(lán)藻菌門為優(yōu)勢(shì)內(nèi)生固氮類群，這 6個(gè)地區(qū)巨菌草中所共有的且相對(duì)豐度最高的內(nèi)生固氮菌群為變形菌門(Proteobacteria)，其相對(duì)豐度為87.56%～99.34%，其中的慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、腸桿菌屬(Enterobacter)和Azohydromonas為共有的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生固氮菌屬，本試驗(yàn)研究結(jié)果與其一致，從巨菌草中篩選出了根瘤菌屬和腸桿菌屬的內(nèi)生細(xì)菌。另外，有34株(占比為18%)的內(nèi)生細(xì)菌具有產(chǎn)鐵載體的能力，促生菌產(chǎn)鐵載體既能增加植物的營(yíng)養(yǎng)供給，又可以與病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵素營(yíng)養(yǎng)從而起到生防作用，是內(nèi)生菌一種重要的促生和防病機(jī)制[26]。

本文研究結(jié)果表明巨菌草中具有豐富促生特性的內(nèi)生細(xì)菌種質(zhì)資源，這對(duì)于巨菌草內(nèi)生固氮菌群資源的開(kāi)發(fā)及其微生物肥料的菌種選育和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。但本文沒(méi)有涉及到巨菌草內(nèi)生真菌的群落多樣性及其組成的研究，下一步通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)將開(kāi)展對(duì)巨菌草內(nèi)生菌的種類、分布及其變化規(guī)律的深入研究。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從巨菌草植株體內(nèi)分離得到187株巨菌草內(nèi)生細(xì)菌，其中86株具有分泌IAA的能力，47株具有溶磷能力，有128株具有潛在的固氮能力，有34株具有產(chǎn)鐵載體的能力，它們分別占全部菌株的46%，25%，64% 和18%。另外，80%以上的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)1種或者多種指示菌具有抑制作用。通過(guò)對(duì)部分促生菌株的16S rDNA基因進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其分別歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)、根瘤菌屬(Rhizobium)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)、腸桿菌屬(Enterobacter)的系統(tǒng)發(fā)育分支，說(shuō)明巨菌草中具促生特性的內(nèi)生細(xì)菌存在豐富的種屬多樣性，這為植物內(nèi)生促生菌的開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。