轉(zhuǎn)Bar基因紫花苜蓿雜交組合的篩選與評(píng)價(jià)

周 仂，王英哲，徐 博，譚 晶，徐安凱*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118; 2. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118； )

紫花苜蓿(Medicagosativa)是起源于伊朗的一種產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)優(yōu)良的牧草，在我國(guó)各地均有分布[1]，在美國(guó)不足200年的栽培歷史中，已成為第四大栽培作物，年經(jīng)濟(jì)收入超過100億美元[2-5]。紫花苜蓿在我國(guó)已有2000多年的栽培歷史，2019年中央1號(hào)文件提出“合理調(diào)整糧經(jīng)飼結(jié)構(gòu)，發(fā)展青貯玉米、苜蓿等優(yōu)質(zhì)飼草料生產(chǎn)”等目標(biāo)任務(wù)，這為紫花苜蓿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供了新的動(dòng)力。

隨著植物基因工程的迅速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在紫花苜蓿遺傳改良方面發(fā)揮著愈加關(guān)鍵的作用[6]。除草劑抗性一直是轉(zhuǎn)基因作物的主要特征。如今轉(zhuǎn)基因作物的全球種植面積已經(jīng)接近2億公頃，且其中抗除草劑作物的種植面積占80%[7]。目前，抗草銨膦基因被較早利用的抗性基因有2種，分別是Bar基因(Bialaphos resistance gene,Bar)和Pat基因(Phosphinothricin N-acetyltransferase gene,Pat)，這2種基因已經(jīng)通過在水稻中的轉(zhuǎn)化成功應(yīng)用于商業(yè)化生產(chǎn)中[8]。陳倩楠等[9]通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將Bar基因穩(wěn)定整合到谷子‘冀谷11’的基因組中。劉艷芝等[10]將Bar基因轉(zhuǎn)入‘草原1號(hào)’苜蓿中，經(jīng)篩選驗(yàn)證，證實(shí)得到的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)除草劑具有抗性。

傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因作物通過回交進(jìn)行育種，并且需要依靠分子標(biāo)記的輔助。丁曉艷等[11]通過回交育種，將FBP7::iaaM基因?qū)攵碳久奁贩N‘晉棉11’，獲得了相比親本纖維產(chǎn)量提高的轉(zhuǎn)基因回交后代JBC4。王文靜等[12]應(yīng)用分子跟蹤檢測(cè)技術(shù)，對(duì)4個(gè)T4代轉(zhuǎn)TaEBP，GhDREB，GmDREB1，GmDREB3基因的小麥通過有限回交、滾動(dòng)回交育種，獲得抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)基因“矮敗周麥18”小麥新種質(zhì)。

利用雄性不育系育種，可以省去人工去雄的工作量，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。雄性不育系在普通雜交育種方面具有廣泛的應(yīng)用，可明顯提高F1代雜交種子生產(chǎn)質(zhì)量與產(chǎn)量，縮短育種周期[13]，但其在轉(zhuǎn)基因作物育種上鮮有應(yīng)用。

本試驗(yàn)以吉林省農(nóng)科院的選育出的優(yōu)良紫花苜蓿雄性不育系(MS-GN-1A)作為母本，篩選優(yōu)異的抗除草劑轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿‘公農(nóng)1號(hào)’為父本，配置雜交組合。對(duì)紫花苜蓿的雜交組合F1代分子水平以及抗除草劑特性等方面進(jìn)行檢測(cè)和相關(guān)分析，結(jié)合農(nóng)藝學(xué)和品質(zhì)性狀篩選出抗除草劑的優(yōu)異雜交組合，為轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿雜交種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)器材

1.1.1試驗(yàn)材料 植物材料：‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿(由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牧草生物技術(shù)育種研究室提供)，雄性不育系MS-GN-1A(由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草地所提供)。以普通‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿為父母本配置1個(gè)對(duì)照組合(CK)，以紫花苜蓿雄性不育系MS-GN-1A為母本，以11個(gè)農(nóng)藝學(xué)性狀有差異的抗除草劑紫花苜蓿株系為父本，配制11個(gè)雜交組合。組合配置編號(hào)見表1。

1.1.2試劑 采購(gòu)由上海佑隆生物公司生產(chǎn)，編號(hào)為AS-013-LS的PAT/Bar轉(zhuǎn)基因速測(cè)試紙；采購(gòu)由北京康為世紀(jì)生物公司生產(chǎn)，編號(hào)為EG101-2的DNA提取試劑盒。

1.1.3試驗(yàn)地基本情況 試驗(yàn)地位于吉林省西部公主嶺市(東經(jīng)124°02′～125°18′，北緯43°11′～44°09)吉林省農(nóng)科院畜牧分院院內(nèi)。該地土壤為退化黑鈣土，肥力中等，該地主要有龍葵(Solanumnigrum)、蒼耳(Xanthiumsibiricum)、小薊(Cirsiumsetosum)、鐵莧菜(Acalyphaaustralis)等多種雜草。F1代雜交種種于吉林省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)生物研究所的溫室內(nèi)。

表1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1雜交F1代抗除草劑特性的檢測(cè)與篩選 在雜交F1代紫花苜蓿進(jìn)入2～3葉期時(shí)用Bar試紙條對(duì)雜交后代進(jìn)行初步篩選，得到Bar試紙條檢測(cè)到的陽(yáng)性紫花苜蓿葉片，然后根據(jù)試劑盒提示提取基因組DNA，檢測(cè)所提取的DNA質(zhì)量。以Bar基因序列作為特異引物用PCR儀(型號(hào)A37834)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 預(yù)變性7 min；94℃ 變性30 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸4 min；4℃ 保存。反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳約2 h，在凝膠成像儀上拍照并保存。Bar基因引物設(shè)計(jì)為：F:5′ATGAGCCCAGAACGACGCCC3′，R:5′CAGAT CTCGGTGACGGGCAGGAC3′。

1.2.2雜交組合產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的測(cè)定 在初花期，對(duì)紫花苜蓿各個(gè)雜交組合F1代的株高和分枝數(shù)進(jìn)行測(cè)量。將各雜交組合的后代全部留茬5 cm進(jìn)行刈割。每組合雜交F1中隨機(jī)挑取10株，進(jìn)行鮮重的測(cè)定，隨后放入溫度為105℃的烘箱殺青15 min，再放入65℃的烘箱烘干至恒重，測(cè)定并記錄莖、葉干重，計(jì)算莖葉比。

莖葉比(stem/leaf,S/L)=莖干重/葉干重

以索氏提取法(參考GB/T6433-2006)測(cè)定粗脂肪；以凱氏定氮法(參考GB/T6432-1994)測(cè)定粗蛋白；以酸堿洗滌重量法測(cè)定粗纖維(參考GB/T6434-1994)含量。

1.2.3灰色關(guān)聯(lián)度分析方法 用X表示12個(gè)雜交組合，用K表示農(nóng)藝學(xué)性狀，以分枝、株高、干重、鮮重、葉莖比、粗纖維、粗脂肪和粗蛋白等8項(xiàng)性狀中的最大值作為參考數(shù)列，記為X0= {X0(1)，X0(2)，X0(3)，……X0(n)}；各雜交組合X在各農(nóng)藝學(xué)性狀k處的值構(gòu)成比較數(shù)列Xi，Xi={Xi(1)，Xi(2)，Xi(3)，……Xi(n)}，其中i=1，2，3，……N，N指的是組合數(shù)目，n為性狀數(shù)目，分別為 12 和 8。具體公式如下：

關(guān)聯(lián)系數(shù)：

(1.1)

等權(quán)關(guān)聯(lián)度：

(1.2)

權(quán)重系數(shù)：

(1.3)

加權(quán)關(guān)聯(lián)度：

(1.4)

其中|X0(k)-Xi(k)|表示絕對(duì)差值△i(k)，minimink|X0(k)-Xi(k)|最小絕對(duì)差，maximaxk|X0(k)-Xi(k)|表示最大絕對(duì)差。ρ代表絕對(duì)分辨系數(shù)，一般在[0，1]，本文取ρ=0.5。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 采用Exce1 2003進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的記錄與統(tǒng)計(jì)，用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析，其中均值的差異顯著性和多重比較分別采用ANOVA和Duncan法分析，灰色關(guān)聯(lián)度分析采用灰色關(guān)聯(lián)度公式與Excel 2003相結(jié)合來完成，各參數(shù)全部采用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交后代的Bar試紙條檢測(cè)

使用Bar試紙條對(duì)雜交后代紫花苜蓿中是否有Bar基因進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)過Bar試紙條快速鑒定得出轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑的紫花苜蓿，部分檢測(cè)結(jié)果如圖1所示：編號(hào)1，2，5，8有2條帶出現(xiàn)，表明是轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑紫花苜蓿陽(yáng)性植株；編號(hào)3，4，6，7，9，10有1條帶出現(xiàn)，表明是轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑紫花苜蓿陰性植株。

圖1 試紙條檢測(cè)結(jié)果

2.2 雜交后代的PCR檢測(cè)

以質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，非轉(zhuǎn)基因苜蓿為陰性對(duì)照，對(duì)Bar試紙條檢測(cè)到的陽(yáng)性苜蓿葉片提取基因組DNA，并以Bar基因序列作為特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR檢測(cè)后，部分檢測(cè)結(jié)果如圖2所示：在11份F1代材料中都發(fā)現(xiàn)了特異性片段，說明配置轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿雜交組合的可行性。

圖2 雜交后代的PCR鑒定圖

2.3 F1代農(nóng)藝學(xué)性狀的分析

將篩選得到的具有草銨膦抗性的雜交后代進(jìn)行農(nóng)藝學(xué)性狀(產(chǎn)量和品質(zhì)性狀)分析，如圖3所示，組合1為對(duì)照組(CK)，株高最高的組合是4，之后依次是組合5、組合12、組合3，株高最低的組合是9，其次是組合6，最高組合比最低組合株高高出23.67 cm。組合3、組合4、組合5、組合7、組合8、組合11和組合12表現(xiàn)較好，株高均高于對(duì)照組合，其中組合4顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

圖3 12個(gè)苜蓿雜交組合株高性狀的比較

如圖4所示，單株分枝數(shù)最多的組合為4，其次是組合3，最低的組合是9，最高組合比最低組合分枝數(shù)高出達(dá)32個(gè)分枝。組合3、組合4、組合5、組合7和組合8表現(xiàn)較好，單株分枝數(shù)均高于對(duì)照組合，其中組合4顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

圖4 12個(gè)苜蓿雜交組合分枝數(shù)的比較

如圖5所示，干草產(chǎn)量最高的是組合4，之后是組合3和組合1，干草產(chǎn)量最低的是組合9，最高組合比最低組合的干重高出0.44 kg。組合3、組合4、組合5、組合7和組合8表現(xiàn)較好，干草產(chǎn)量均高于對(duì)照組合，其中組合4顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

如圖6所示，鮮草產(chǎn)量最高的組合是4，其次是組合3、組合5和組合8，鮮草產(chǎn)量最低的組合是9，其次是組合12，最高組合比最低組合的鮮重高出0.68 kg。組合3、組合4、組合5、組合7和組合8表現(xiàn)較好，鮮草產(chǎn)量均高于對(duì)照組合，其中組合4顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

圖5 12個(gè)苜蓿雜交組合干重的比較

圖6 12個(gè)苜蓿雜交組合鮮重的比較

如圖7所示，葉莖比最高的組合是4，最低的是組合2，各組合葉莖比從大到小依次是：組合4>組合5>組合3>組合8>組合12>組合7>組合1>組合11>組合10>組合6>組合9>組合2。組合3、組合4、組合5、組合7、組合8和組合12表現(xiàn)較好，葉莖比均高于對(duì)照組合。

圖7 12個(gè)苜蓿雜交組合葉莖比的比較

如圖8所示，粗蛋白最高的是組合5，最低的是組合6，各組合粗蛋白百分比從大到小依次是：組合5>組合3>組合4>組合12>組合8>組合7>組合1>組合10>組合11>組合2>組合9>組合6。組合3、組合4、組合5、組合7、組合8和組合12表現(xiàn)較好，粗蛋白百分比均高于對(duì)照組合，其中組合3、組合4、組合5、組合8和組合12顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

圖8 12個(gè)苜蓿雜交組合粗蛋白的比較

如圖9所示，粗脂肪最高的是組合8，最低的是組合9，各組合粗脂肪百分比從大到小依次是：組合8>組合5>組合4>組合3>組合7>組合12>組合1>組合11>組合2>組合6>組合10>組合9。組合3、組合4、組合5、組合7、組合8和組合12表現(xiàn)較好，粗脂肪百分比均高于對(duì)照組合，其中組合8顯著高于對(duì)照組合(P<0.05)。

如圖10所示，粗纖維百分比最高的組合是9，最低的是組合8，各組合粗纖維百分比從大到小依次是：組合9>組合10>組合6>組合2>組合11>組合1>組合12>組合7>組合3>組合4>組合5>組合8，粗纖維含量的變化規(guī)律與粗蛋白含量相反。組合3、組合4、組合5、組合7、組合8和組合12表現(xiàn)較好，粗纖維百分比均低于對(duì)照組合，其中組合3，組合4，組合5，組合8顯著低于對(duì)照組合(P<0.05)。

圖9 12個(gè)苜蓿雜交組合粗脂肪的比較

圖10 12個(gè)苜蓿雜交組合粗纖維百分比的比較

2.4 雜交后代農(nóng)藝學(xué)性狀的灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.4.1原始數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理 本試驗(yàn)包括的8項(xiàng)指標(biāo)分別為：株高、分枝數(shù)、鮮重、干重、粗脂肪、粗蛋白、粗纖維和葉莖比。各雜交組合的等權(quán)和加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值，如表2，3所示。

表2 各雜交組合的等權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值

表3 各雜交組合的加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)值

2.4.2各雜交組合的關(guān)聯(lián)度分析 由表4可知，加權(quán)關(guān)聯(lián)度和等權(quán)關(guān)聯(lián)度的各項(xiàng)指標(biāo)的排列順序基本一致，但個(gè)別幾項(xiàng)有細(xì)小出入，最后對(duì)各個(gè)指標(biāo)的等權(quán)關(guān)聯(lián)度結(jié)果進(jìn)行由大到小的順序排列：γ4>γ8>γ5>γ3>γ11>γ12>γ7>γ1>γ10>γ6>γ2>γ9，加權(quán)關(guān)聯(lián)度結(jié)果進(jìn)行由大到小的順序排列：γ4>γ5>γ3>γ8>γ11>γ12>γ7>γ1>γ10>γ2>γ9>γ6，優(yōu)勢(shì)組合除組合3、組合5和組合8，劣勢(shì)組合除組合2、組合6和組合9在加權(quán)和等權(quán)關(guān)聯(lián)度分析位次中有些許差異，基本上等權(quán)關(guān)聯(lián)度和加權(quán)關(guān)聯(lián)度呈正相關(guān)的關(guān)系，優(yōu)勢(shì)組合和劣勢(shì)組合兩種關(guān)聯(lián)度法表現(xiàn)基本一致。優(yōu)勢(shì)組合包括組合3，4，5，7，8，11，12，各種性狀綜合表現(xiàn)突出，綜合性狀高于對(duì)照組合；劣勢(shì)組合包括組合2，6，9，10，各種性狀綜合表現(xiàn)較差，綜合性狀低于對(duì)照組合。

表4 各雜交組合的關(guān)聯(lián)度及排序

3 討論

3.1 紫花苜蓿雜交后代抗性分析

抗除草劑育種是最早開展和應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因育種，由于紫花苜蓿本身組織培養(yǎng)再生性差，重復(fù)性低等原因，從而造成轉(zhuǎn)化率低、遺傳或表達(dá)不穩(wěn)定等問題。因此，利用轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)手段來改良紫花苜蓿的遺傳特性受到很大限制。如何利用好現(xiàn)有的紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因材料，培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)且抗除草劑的苜蓿品種是本試驗(yàn)主要研究的問題。

本試驗(yàn)利用抗除草劑基因紫花苜蓿和雄性不育系紫花苜蓿進(jìn)行雜交，使轉(zhuǎn)基因技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法有效結(jié)合，發(fā)揮各自優(yōu)勢(shì)，加快和完善轉(zhuǎn)基因目標(biāo)性狀導(dǎo)入紫花苜蓿的進(jìn)程。國(guó)內(nèi)外研究表明外源基因在受體作物內(nèi)的遺傳表達(dá)很不穩(wěn)定，易出現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象[14-15]?？钩輨┺D(zhuǎn)基因作物的目的基因遺傳表現(xiàn)復(fù)雜，部分轉(zhuǎn)基因作物自交后代表現(xiàn)3∶1分離規(guī)律，與非轉(zhuǎn)基因親本雜交后代表現(xiàn)1∶1分離規(guī)律，但也有一部分除草劑轉(zhuǎn)基因作物的表現(xiàn)不符合孟德爾分離規(guī)律[16]。本試驗(yàn)以轉(zhuǎn)Bar基因紫花苜蓿為父本，雄性不育系紫花苜蓿為母本，進(jìn)行人工雜交。對(duì)雜交組合F1代進(jìn)行抗性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)均有特異性條帶出現(xiàn)，證明這些后代中已經(jīng)存在抗除草劑基因。孟慶忠[17]采用農(nóng)達(dá)41%水劑作為殺雄劑與轉(zhuǎn)EPSPS基因的棉花進(jìn)行雜交棉制種，棉花雜交種純度不低于96%。本試驗(yàn)研究結(jié)果與其相似，獲得的F1代純度在98%以上。

3.2 紫花苜蓿雜交后代產(chǎn)量及品質(zhì)性狀的分析

苜蓿雄性不育系的選育及其利用已成為當(dāng)前苜蓿生產(chǎn)中的熱點(diǎn)，一旦雜種優(yōu)勢(shì)獲得顯著增產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的效果，就可以大幅度提升該品種的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[18]。吳永敷等[19]研究提出利用苜蓿雄性不育是獲得雜種優(yōu)勢(shì)以得到高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗逆的苜蓿品種的有效途徑。Brummer[20]指出雄性不育系的選育是苜蓿雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，利用雄性不育系和常規(guī)品種雜交獲得的F1代能夠有效避免自交衰退。特木爾布和等[21]以MS-4配置40個(gè)雜交組合，得到雜交F1代的產(chǎn)量與對(duì)照相比平均增產(chǎn)25.2%。本研究結(jié)果與其相似，本試驗(yàn)中雜交組合3、組合4、組合5、組合7、組合8的F1代鮮草產(chǎn)量和干草產(chǎn)量均高于組合1(CK)，初步說明這幾個(gè)雜交組合得到的后代在產(chǎn)量方面優(yōu)于常規(guī)品種的雜交后代。

粗蛋白含量是劃分紫花苜蓿等級(jí)的重要標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。一般來說優(yōu)質(zhì)的紫花苜蓿干草中粗蛋白含量大于18%[22]。粗脂肪是提供能量的主要物質(zhì)，其重要性僅次于粗蛋白，其含量影響苜蓿的適口性。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雜交組合3、組合4、組合5、組合7、組合8、組合12的F1代中粗蛋白和粗脂肪含量均高于常規(guī)品種的雜交后代(CK)，且粗蛋白含量均在18%以上，說明本試驗(yàn)選取的常規(guī)材料‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿為優(yōu)質(zhì)苜蓿，以上6個(gè)雜交組合在品質(zhì)方面體現(xiàn)出雜種優(yōu)勢(shì)。根據(jù)2006年我國(guó)頒布的牧草草產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)[23]指標(biāo)規(guī)定，試驗(yàn)中雜交組合5為一級(jí)(粗蛋白質(zhì)含量：20%～22%)牧草、雜交組合3、組合4、組合7、組合8、組合12為二級(jí)(粗蛋白質(zhì)含量：18%～20%)牧草。

研究發(fā)現(xiàn)，雜交組合2、組合6、組合9、組合10、組合11的F1代的產(chǎn)量與品質(zhì)均低于對(duì)照，未獲得雜種優(yōu)勢(shì)，可能與親本的性狀有關(guān)，尤其是轉(zhuǎn)基因材料，親本的性能比常規(guī)品種稍弱一些。

3.3 紫花苜蓿雜交后代產(chǎn)量、品質(zhì)相關(guān)性分析研究

產(chǎn)量是衡量植物生產(chǎn)性能和經(jīng)濟(jì)性能的重要指標(biāo)[24]，因此，高產(chǎn)育種對(duì)紫花苜蓿尤為重要。紫花苜蓿產(chǎn)量是受多基因控制的數(shù)量性狀，遺傳和環(huán)境對(duì)產(chǎn)量影響較大，主要由單株株高、分枝數(shù)等多個(gè)性狀與環(huán)境互作的結(jié)果[25]。海棠[26]認(rèn)為產(chǎn)量大小是產(chǎn)量各構(gòu)成因子平衡的結(jié)果，產(chǎn)量的高低取決于各因子間能夠達(dá)到最佳平衡狀態(tài)。以往對(duì)苜蓿產(chǎn)量的研究普遍認(rèn)為，株高與干草產(chǎn)量、鮮草產(chǎn)量呈顯著或極顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)通過11個(gè)雜交組合的產(chǎn)量因子分析研究表明，鮮草產(chǎn)量、干草產(chǎn)量均與株高和分枝數(shù)呈極顯著正相關(guān)，說明株高與分枝數(shù)對(duì)苜蓿產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的形成非常重要，這與已有的研究[27]結(jié)果基本一致。趙松義等[28]認(rèn)為優(yōu)良的煙草雜種F1代，不僅產(chǎn)量具有超親表現(xiàn)，農(nóng)藝性狀與煙葉產(chǎn)量?jī)?yōu)勢(shì)的形成也密切相關(guān)，本研究結(jié)果與其相似。

3.4 F1代產(chǎn)量和品質(zhì)的灰色關(guān)聯(lián)度分析與評(píng)價(jià)

評(píng)價(jià)牧草的好壞的因子很多，僅以單一性狀的方差分析作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)在一定程度上有失全面或無所側(cè)重[29]。鄧聚龍[30]的灰色關(guān)聯(lián)分析法中，等權(quán)關(guān)聯(lián)度可反映草種間差異大小，即關(guān)聯(lián)度越大的因素，相似度越高[31]。加權(quán)關(guān)聯(lián)系數(shù)可真實(shí)反應(yīng)出供試材料與最優(yōu)指標(biāo)的差異，即關(guān)聯(lián)度越大，該材料與最優(yōu)指標(biāo)越接近，且相關(guān)研究證明，加權(quán)關(guān)聯(lián)度更能準(zhǔn)確反應(yīng)供試材料的優(yōu)劣[32]。

本試驗(yàn)對(duì)12個(gè)雜交組合的產(chǎn)量及品質(zhì)性狀進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果表明組合4的等權(quán)關(guān)聯(lián)度與加權(quán)關(guān)聯(lián)度均排名第一，可能與該組合草產(chǎn)量大、粗蛋白和粗脂肪含量高有重要關(guān)系。本試驗(yàn)結(jié)果表示，組合3，5，8，11，12的產(chǎn)量與品質(zhì)性狀指標(biāo)相對(duì)較高，與參考材料有較大的相似度，使綜合排名相對(duì)靠前，均在組合1(CK)之上，說明以上的雜交組合后代表現(xiàn)出不同程度的雜種優(yōu)勢(shì)，各指標(biāo)性狀均優(yōu)于常規(guī)品種。由此可以看出，株高、分枝數(shù)、干草產(chǎn)量、鮮草產(chǎn)量、莖葉比對(duì)紫花苜蓿綜合生產(chǎn)性能最大。賈瑞等[33]對(duì)不同紫花苜蓿雜交組合F1代的生物學(xué)特性的研究表示紫花苜蓿的選育過程中應(yīng)將單株分枝數(shù)、干草產(chǎn)量、粗蛋白粗脂肪作為主要考慮因子，本試驗(yàn)結(jié)果與其不完全一致，這可能由于試驗(yàn)選擇的雜交組合親本品種不同，前者選用的雜交親本多為國(guó)外品種，本試驗(yàn)則是選用國(guó)內(nèi)東北地區(qū)的當(dāng)家品種，兩者親本的遺傳差異較大，另外也與栽培環(huán)境等條件不同有關(guān)。

3.5 三系配套技術(shù)在轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿育種中的應(yīng)用

農(nóng)業(yè)多樣化對(duì)牧草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著積極而又深遠(yuǎn)的影響[34]。我國(guó)在應(yīng)用生物技術(shù)進(jìn)行牧草遺傳改良方面已經(jīng)取得了許多成就[35]。王木月等[36]通過回交轉(zhuǎn)育的手段，把抗除草劑基因Bar導(dǎo)入到多個(gè)秈稻(OryzasativaL.)品種中，并選育出不同基因組合的秈型轉(zhuǎn)基因水稻株系。本試驗(yàn)以優(yōu)良紫花苜蓿雄性不育系作為母本、優(yōu)異的抗除草劑轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿公農(nóng)1號(hào)為父本，配置雜交組合，得到具有抗除草劑特性的雜交組合F1代。

根據(jù)已有研究[37-38]，轉(zhuǎn)基因作物的育種方法主要是集中在以分子標(biāo)記為輔助的回交育種法，但是轉(zhuǎn)基因作物與現(xiàn)有且相應(yīng)的雄性不育系進(jìn)行雜交育種的研究鮮有報(bào)道，在抗除草劑轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中尚未見相關(guān)研究。使用雄性不育系來組配雜交種，可免去人工去雄的繁瑣問題，簡(jiǎn)化了雜交育種的進(jìn)程，提高了雜交種種子產(chǎn)量和制種效率，并使雜交種的產(chǎn)量和質(zhì)量得到保證[39]。本試驗(yàn)將轉(zhuǎn)基因技術(shù)的研究和應(yīng)用與現(xiàn)有的紫花苜蓿苜蓿育種技術(shù)結(jié)合，通過雜交的方式，抗除草劑紫花苜蓿的轉(zhuǎn)基因特性可以穩(wěn)定遺傳到F1代。這樣不僅可以縮短育種周期，節(jié)省資源，而且目標(biāo)性狀也能得到穩(wěn)定統(tǒng)一的遺傳，抗除草劑轉(zhuǎn)基因苜蓿也可以更加高效穩(wěn)定的參與到現(xiàn)代的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式中。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)針對(duì)抗除草劑轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿F1代的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀，采用灰色關(guān)聯(lián)度的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)和篩選，試驗(yàn)結(jié)果得到7組優(yōu)秀的雜交組合。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過抗除草劑紫花苜蓿與非轉(zhuǎn)基因雄性不育紫花苜蓿雜交后代分析研究，發(fā)現(xiàn)抗除草劑Bar基因可穩(wěn)定遺傳給后代，說明Bar可以通過雜交轉(zhuǎn)育的方式轉(zhuǎn)入其他非轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿中。

相關(guān)性分析結(jié)果表明，紫花苜蓿鮮草產(chǎn)量、干草產(chǎn)量均與株高和分枝數(shù)呈極顯著正相關(guān)?；疑P(guān)聯(lián)度分析表明，株高、分枝數(shù)、干草產(chǎn)量、鮮草產(chǎn)量、莖葉比對(duì)紫花苜蓿綜合生產(chǎn)性能最大。

通過綜合性能指標(biāo)評(píng)定，組合4為最佳雜交組合，其次，組合3，5，7，8，11，12也表現(xiàn)出不同程度的雜種優(yōu)勢(shì)，均可作為配置雜交組合儲(chǔ)備的材料。