硫模塊啟動子對提高L-甲硫氨酸的生物合成的影響及發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

金利群，金偉熔，柳志強*

1(浙江省生物有機合成技術研究重點實驗室(浙江工業(yè)大學)，浙江 杭州，310014) 2(生物轉化與生物凈化教育部工程研究中心(浙江工業(yè)大學)，浙江 杭州，310014) 3(手性生物制造國家地方聯(lián)合工程研究中心(浙江工業(yè)大學)，浙江 杭州，310014)

甲硫氨酸(methionine, Met, (S)-2-Amino-4-(methylthio)butanoic acid)[1-2]是必需氨基酸中唯一含硫元素的氨基酸，分為L型和D型2種同分異構體，在自然界中主要以L型為主。在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中甲硫氨酸被視為是家禽[1]的第一限制性氨基酸。

生物合成途徑中細胞代謝通量的平衡依賴于關鍵代謝物、酶和調節(jié)因子的協(xié)調[14-15]。目標產(chǎn)物的合成總是由多種酶協(xié)同催化完成，代謝工程的發(fā)展需要通過理性設計代謝途徑進一步完善目標產(chǎn)物形成[16-18]。啟動子工程提供了具有不同強度和功能的各種啟動子，并且已被公認為精確控制代謝工程中基因表達的有效工具[18]。

已有研究報道通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加Na2S2O3，顯著提高了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量[19]，這為通過硫模塊優(yōu)化提高L-甲硫氨酸的生物合成提供了重要的思路。本文以實驗室前期工作中構建的重組菌E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H為出發(fā)菌株，通過基因表達，確定了硫代謝模塊中的關鍵酶；在此基礎上，研究了強啟動子介入和關鍵基因共表達對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；并進一步優(yōu)化了培養(yǎng)基主要組分的濃度，為提高L-甲硫氨酸的生物合成提供了良好的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株和質粒

本文中所使用的菌株及相關基因型見表1，質粒說明見表2。

表1 主要菌株與說明Table 1 Main strains and relevant instructions

表2 主要質粒與說明Table 2 Main plasmids and relevant instructions

1.1.2 主要工具酶、試劑和試劑盒

限制性內(nèi)切酶EcoRI FastDigest、NcoI FastDigest、BamHI FastDigest、XbaI FastDigest、KpnI FastDigest、SalI FastDigest、PstI FastDigest和BcuI FastDigest，以及RNA提取試劑盒PureLinkTMRNA Mini Kit，Thermo Fisher Scientific公司；PCR擴增酶Pfu酶、Taq酶，博彩生物公司；ClonExpressTMOneStep Cloning Kit連接試劑盒、HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒，諾維贊公司；基因組提取試劑盒FastDNA?Spin Kit for Soil，MPbio；質粒DNA小量抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，Axygen生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器和設備

Biometra PCR儀，Biometra公司；Sorvall Lynx 4000高速冷凍離心機，Thermo Scinentific公司；Mini-Protean Ⅱ型電泳儀、GelDoc凝膠成像儀，Bio-Rad公司；5417R小型臺式高速冷凍離心機、熒光定量PCR儀22331 Hamburg，德國Eppendorf公司；MS-100恒溫金屬振蕩反應器，杭州奧盛儀器有限公司；NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Thermo公司；UltiMate3000高效液相色譜，美國戴安公司；電穿孔儀MicroPulserTM，上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司等。

1.2 實驗方法

1.2.1 構建含有甲硫氨酸硫代謝通路中關鍵基因glpE、grx1、cysK、cysM或nrdH的雙表達質粒

用FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒提取E.coliW3110菌株的基因組DNA，以該基因組為模版，通過PCR獲得目的基因序列。然后通過對表達載體pTrc99A使用限制性內(nèi)切酶雙酶切以線性化，膠回收純化回收目的片段。采用諾維贊ClonExpressTMOneStep Cloning Kit試劑盒連接線性化載體和目的基因片段。涂布至LB平板(100 μg/mL Amp)上篩選，挑選單菌落進行菌落PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳驗證，測序驗證陽性克隆，獲得以pTrc99A質粒為載體的重組質粒pTrc-grx1、pTrc-glpE、pTrc-cysM、pTrc-cysK和pTrc-nrdH。

提取上述質粒作為模板，通過PCR克隆得到序列trc至與其對應的終止子序列。提取E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H的質粒pA*H，同時通過PCR線性化pA*H質粒的trc啟動子上游。借助諾維贊ClonExpressTMOne Step Cloning Kit試劑盒將trc啟動子表達的目的基因插入到質粒pA*H上游，得到pA*H-trc-grx1、pA*H-trc-glpE、pA*H-trc-cysK和pA*H-trc-nrdH4個重組質粒，進行菌落PCR驗證后送公司測序。

共表達質粒的構建通過在以上構建的pTrc-target gene上采用酶切連接的方法繼續(xù)插入基因，得到pTrc-nrdH-glpE的共表達質粒，克隆目標序列片段，重復上述方法可以構建得到pA*H-trc-nrdH-glpE質粒。

1.2.2 CRISPR-Cas9基因組改造[20]獲得E.coliW3110 JAHFEBL/trc-cysK

以E.coliW3110 JAHFEBL/trc-cysK的構建為例。使用基因組提取試劑盒提取E.coliW3110基因組。以提取到的基因組為模版擴增獲得donor DNA上游同源臂片段和下游同源臂片段，通過融合PCR獲得donor DNA。將donor DNA片段連接至T載體，獲得T-donor DNA質粒，以之為模板，使用同源臂PCR體系擴增donor DNA片段，通過Clean Up試劑盒將質量濃度濃縮至900 ng/L以上。

PCR突變pTarget質粒并用BcuI FastDigest和DpnI酶切，T4連接酶16 ℃過夜自連，轉入E.coliDH5α感受態(tài)細胞中，提取質粒并送測序。

將donor DNA片段和pTarget -cysK質粒各0.5 μL通過電擊轉化到含有pCas質粒的E.coliW3110 JAHFEBL電轉感受態(tài)中，涂布SD(50 μg/mL)和kan(50 μg/mL)雙抗性平板30 ℃培養(yǎng)篩選，PCR驗證陽性克隆并測序驗證。消除pCas和pTarget質粒，獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株。

1.2.3 啟動子文庫構建

以pLVX-AcGFP1-N1載體為模板，PCR擴增綠色熒光蛋白目的基因AcGFP1。通過限制性內(nèi)切酶Thermo ScientificTMFastDigestEcoRI和HindIII對質粒pTrc99A進行酶切。將目的基因PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物使用AXYGEN AxyPrepTM PCR Cleanup Kit試劑盒純化后，再利用諾維贊ClonExpressTMOneStep Cloning Kit試劑盒連接兩者，成功構建重組質粒pTrc99A-AcGFP1。經(jīng)DNA測序鑒定得到正確的陽性克隆轉化子。

以重組質粒pTrc99A-AcGFP1為模板，分2次PCR突變質粒中trc啟動子的-35到-1區(qū)域，擴增得到含有PG3啟動子重組質粒pPG3-AcGFP1。經(jīng)DNA測序鑒定得到正確的陽性克隆轉化子。

設計重組質粒pPG3-AcGFP1的單點突變引物對質粒pPG3-AcGFP1上的PG3啟動子的-35 box到+1 box逐個堿基進行單點突變，每個位點分別突變?yōu)镹(A/T/C/G)，依序將每4個PCR產(chǎn)物純化并濃縮至同一個PCR管中，轉化到E.coliW3110感受態(tài)菌株中，涂布到含有100 μg/L Amp的LB平板中，37 ℃培養(yǎng)后，獲得轉化單菌落。將單菌落接種96孔板(每個孔800 μL含有0.1 μg/mL Amp的LB培養(yǎng)基)中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h后，將200 μL菌液轉接到另一個96孔板(每個孔中800 μL含有0.1 μg/mL Amp和0.024 μg/mL IPTG的LB培養(yǎng)基)中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)12 h。

結束培養(yǎng)后于4 000×g，4 ℃離心10 min，去掉上清液，用pH 7.0的PBS磷酸緩沖溶液洗滌菌體2次后,加入1 mL PBS磷酸緩沖液(50 mmol/L)重懸菌體。取菌體溶液200 μL分別在波長為600 nm的條件下測量吸光度。然后取重懸的菌體溶液200 μL用熒光分光光度計在激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為520 nm條件下測量其相對熒光值，即RFU值。如果測量的RFU值和OD600超出儀器檢測線性范圍，則用RBS溶液稀釋一定倍數(shù)后再次測量。最后根據(jù)RFU/OD600的比值來衡量啟動子的強弱。

1.2.4 p32啟動子替換質粒構建

以pA*H-p32-nrdH-glpE質粒的構建為例。提取pTrc-nrdH-glpE質粒，PCR對啟動子區(qū)域進行突變，獲得質粒p32-nrdH-glpE，轉入到E.coliDH5α感受態(tài)細胞中擴增質粒，菌落PCR檢測并測序。然后利用1.2.1的質粒構建方法獲得質粒pA*H-p32-nrdH-glpE。

1.2.5 菌株培養(yǎng)方法

用接種環(huán)從LB固體平皿培養(yǎng)基(2%瓊脂，100 μg/mL Amp)中挑選單菌落轉接至含LB培養(yǎng)基(100 μg/mL Amp)的試管中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h。將上述培養(yǎng)好的種子液，以5%(體積分數(shù))的接種量轉接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃，180 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)2 h。加入4 μL IPTG母液(0.12 g/mL)后28 ℃，180 r/min繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，(NH4)2SO416 g/L，KH2PO41 g/L，Na2S2O31 g/L，酵母提取物2 g/L，金屬離子1 mL/L。500 mL搖瓶培養(yǎng)基裝液量為20 mL。其中金屬離子為MgSO4·H2O 500 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg/L，MnSO4·8H2O 5 mg/L，ZnSO45 mg/L溶于超純水。115 ℃高溫蒸汽滅菌30 min。在接種時加入VB12母液(20 μg/mL)、賴氨酸(10 mg/L)、Amp(100 μg/mL)，以及分裝滅菌的CaCO3固體0.20 g。

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化

利用單因素實驗，分別考察了不同葡萄糖添加量(20～60 g/L)，硫代硫酸鈉添加量(0.5～5.0 g/L)、氮源添加量(1.0～3.5 g/L)、(NH4)2SO4濃度(8～28 g/L)和KH2PO4添加量(0.5～3.0 g/L)對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。

1.2.7 分析方法

1.2.7.1L-甲硫氨酸的HPLC檢測

取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL EP中，12 000×g離心2 min，保存上清；將100 μL上清液稀釋至1.5 mL EP管中，加入100 μL 0.5 mol/L的NaHCO3溶液和100 μL體積分數(shù)1%的2,4-二硝基氟苯乙腈溶液，60 ℃避光反應60 min；再用0.22 μm有機膜進行過濾，用以高效液相色譜檢測。

L-甲硫氨酸檢測條件：分析柱為C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為V(甲醇)∶V(水)=1∶1：其中，水相由1.5 mL乙酸和2.05 g乙酸鈉溶于1 L超純水，調pH值至3.5；柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，紫外波長365 nm，時間16 min。

標準品的制備：采用外標法定量，分別配制質量濃度0.5～2.5 g/L的L-甲硫氨酸標準溶液，依次對不同濃度的標準溶液進行HPLC分析檢測，以標準溶液的峰面積X為橫坐標，以標準溶液的濃度Y(g/L)為縱坐標，繪制標準曲線，并得回歸方程。

1.2.7.2 熒光定量PCR檢測

在發(fā)酵培養(yǎng)12 h時取樣，取1mL發(fā)酵液于1.5 mL EP中，12 000×g離心2 min，分離上清液。在1.5 mL離心管沉淀中加入1 mL蒸餾水洗滌后，再加入1 mL體積分數(shù)20%乙酸溶液混勻，充分中和沉淀中的CaCO3。使用PureLinkTMRNA Mini Kit試劑盒提取并純化RNA。提取的總RNA按照500 ng使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑盒反轉錄獲得cDNA。以E.colik-12 MG1655的16S rRNA作為對照基因。每組設置3個平行，將cDNA樣品作為模板上機檢測。

2 結果與分析

2.1 trc啟動子替換菌株構建

2.1.1trc啟動子提高grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM表達對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

從基因組上克隆得到目的基因grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM，通過在質粒pA*H上插入包括trc啟動子的轉錄元件，過表達grx1、glpE、cysK、nrdH和cysM基因，獲得E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-grx1、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-glpE、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-cysK、E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-nrdH和E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H-trc-cysM菌株(如圖1)，檢測這些重組菌株的甲硫氨酸產(chǎn)量以探究關鍵基因。如圖2所示，作為非cysM依賴通路，glpE能轉化硫代硫酸鹽生成亞硫酸鹽[8]，過表達glpE使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了約15.3%。過表達cysK能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高約12.6%。由于nrdH在細胞內(nèi)的過表達可以將S-磺酸半胱氨酸(SSC)轉化為L-半胱氨酸和亞硫酸鹽，表達攜帶nrdH的質?？梢蕴岣週-半胱氨酸的代謝水平[7]，過表達nrdH也能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量有近8%的提升。

通過分析重組菌生長結果發(fā)現(xiàn)質粒上表達單一基因對菌體的生長狀況影響并不顯著(圖3)。可見，cysM、cysK、glpE、nrdH和grx1并非通過增加菌體量提升L-甲硫氨酸的合成水平。

2.1.2 共表達基因glpE、nrdH和cysK對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

根據(jù)上述結果將glpE、nrdH在E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株中共表達。使用CRISPR-Cas9技術在基因組上用trc啟動子替換cysK的啟動子獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株，L-甲硫氨酸的產(chǎn)量提升約11.3%；在此基礎上過表達glpE基因獲得E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-glpE菌株，其產(chǎn)量相較對照組提升了約23.4%；而E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相較對照組提升了16.8%。同時在質粒pA*H上共表達glpE和nrdH基因，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相較對照組提升了28.2%(圖4)。L-甲硫氨酸的產(chǎn)量提升并非由菌體量增加引起(圖5)。

圖1 雙表達載體質粒的構建Fig.1 Construction of the double expression recombinant plasmids

圖2 質粒上分別過表達基因grx1, glpE, cysK,nrdH和cysM對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Influence of grx1, glpE, cysK, nrdH and cysM overexpressions in plasmids to the titer of L-methionine注：相比對照組，P值<0.01表示實驗組差異非常顯著(***)，P值處于0.01～0.05之間表示實驗組差異顯著(**)，P值處于0.05～0.16之間表示實驗組差異輕微顯著(*)。下同。

圖3 質粒上分別過表達基因grx1, glpE, cysK,nrdH和cysM對菌體生長的影響Fig.3 Influence of grx1, glpE, cysK, nrdH and cysM overexpressions in plasmids to the growth of the strains

圖4 多基因共表達對L-甲硫氨酸的影響Fig.4 Influence of multigene coexpression to the titer of L-methionine

圖5 多個目的基因共表達對菌體生長的影響Fig.5 Influence of the multigene co-expression to the growth of strains

2.2 高強度PG3突變啟動子的獲得

2.2.1 啟動子文庫構建

為了獲得更高強度的啟動子以優(yōu)化2.1中關鍵基因的表達水平，選擇PG3[21]為模板構建啟動子文庫，序列為TTGACATTGGAAGGGAGATTCTTTATAATAAGAATT,該啟動子由原始啟動子雜合而成，具有良好的轉錄活性和較高的突變潛力。通過分析單點突變對啟動子影響，組合突變位點，最終獲得包含32個樣本的突變啟動子文庫。如圖6所示，其RFU/OD600比值跨度從最低的256.3到最高的8 351.2，跨度適中，滿足了下游基因對不同強度調控的需求。其與PG3啟動子相比，強度變化范圍為11.8%～385.3%。

圖6 PG3突變啟動子文庫Fig.6 PG3 mutation prompter library注：從左到右按pG3,p1,p2…p31,p32排列。

2.2.2 熒光定量PCR比較trc和p32啟動子強度

分別采用發(fā)酵培養(yǎng)基模擬發(fā)酵條件，培養(yǎng)攜帶p32-AcGFP和pTrc-AcGFP質粒的E.colik-12 W3110菌株。取發(fā)酵12 h的菌液使用熒光定量PCR檢測突變啟動子p32相對trc啟動子的轉錄水平。p32啟動子核心區(qū)域序列為TTGACAGAGGCAGGG CGACATTTTATAATAAGACTT。

本文比較了AcGFP在p32和trc啟動子驅動下的轉錄水平差異(表3)，相比于trc啟動子，突變文庫中熒光強度最高的突變啟動子p32的轉錄水平提高了約150%，這可以進一步上調E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株硫同化模塊關鍵酶的表達，在目標宿主菌株中具有較好的應用價值。

表3 啟動子p32和trc對AcGFP轉錄水平的影響Table 3 Effect of promoter p32 and trc on the transcription levels of AcGFP

2.3 p32啟動子替換

2.3.1 基因glpE和cysK不同啟動子對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響

由于提高glpE和cysK的表達能有效提高菌體L-甲硫氨酸的產(chǎn)量，考慮通過提高基因組上glpE的表達量以減少質粒上串聯(lián)表達的基因數(shù)。通過分別優(yōu)化cysK和glpE基因的表達效果，比較兩者差異，選擇較優(yōu)菌株。

如圖7所示，在基因組水平用p32啟動子替換glpE原始啟動子能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高15.4%，而在質粒上用p32啟動子過表達glpE的菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量則提高了21.2%，因此選擇在質粒上使用p32過表達glpE。用p32啟動子替換cysK原始啟動子能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高15.2%，而用trc啟動子替換cysK原始啟動子則使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了24.2%，因此在基因組上使用p32替換cysK啟動子提高其表達量。

圖7 基因glpE和cysK對L-甲硫氨酸產(chǎn)量最優(yōu)表達Fig.7 Optimization of glpE and cysK expressions to L-methionine

2.3.2 p32在菌株中的應用

使用p32啟動子替換pA*H-trc-nrdH-glpE和pA*H-trc-nrdH-grx1-glpE質粒中trc啟動子，獲得pA*H-p32-nrdH-glpE和pA*H-p32-nrdH-grx1-glpE質粒，轉入到E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK菌株中比較L-甲硫氨酸的產(chǎn)量。實驗結果如圖8所示，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量達到1.3 g/L，相較原始菌株提高了41.5%，相較E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE菌株提高了12.0%。

圖8 p32啟動子應用對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Influence of applying p32 promoter to the titer of L-methionine

2.4 培養(yǎng)基組分優(yōu)化

培養(yǎng)基組分優(yōu)化結果如圖9所示。結果表明，40 g/L的葡萄糖添加量可以使L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高13.8%，但繼續(xù)提高葡萄糖的添加量，實驗結果L-甲硫氨酸產(chǎn)量，反而出現(xiàn)下降的趨勢。進一步研究發(fā)現(xiàn)葡萄糖添加量在30 g/L和40 g/L之間時，L-甲硫氨酸產(chǎn)量存在上升空間。通過細化葡萄糖添加量的濃度梯度，可知，在添加34 g/L葡萄糖時L-甲硫氨酸產(chǎn)量達到最高，提升約18.6%(如圖9-B)。

考慮到重組菌株的改造集中在硫代硫酸鹽利用途徑中，提高硫代硫酸鹽的供給對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的提升應該有較為重要的意義[19]。因此，在碳源優(yōu)化的基礎上考察了硫代硫酸鈉的添加量對菌株發(fā)酵的影響。實驗結果如圖9-C所示，硫代硫酸鈉的添加量增加至3 g/L時，L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了41.3%，而繼續(xù)提高硫代硫酸鈉的供給并不能使L-甲硫氨酸產(chǎn)量進一步提升。降低硫代硫酸鈉的濃度(0.5 g/L)使L-甲硫氨酸產(chǎn)量急劇下降，為對照組的48.8%。硫代硫酸鈉的添加對菌體生物量沒有造成影響，整體相差并不明顯。

進一步考察了氮源添加量對菌體發(fā)酵的影響。如圖9-D所示，當酵母提取物添加量為2.0 g/L時，菌體生物量和L-甲硫氨酸產(chǎn)量最優(yōu)。如圖9-E所示，培養(yǎng)基中提高硫酸銨的濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量和菌體生物量并沒有明顯促進作用，相反，過高的銨鹽濃度會對細胞生長產(chǎn)生抑制[22]。

如圖9-F所示，當KH2PO4添加量提高至2.0 g/L時，重組菌株的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提高了約9.7%；在此基礎上繼續(xù)提高KH2PO4濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量并沒有顯著的影響。

A-葡萄糖添加濃度(20～60 g/L)對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；B-葡萄糖添加濃度(32～40 g/L)對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；C-硫代硫酸鈉添加濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；D-酵母提取物添加濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；E-(NH4)2SO4添加濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響；F-KH2PO4添加濃度對L-甲硫氨酸產(chǎn)量的影響圖9 培養(yǎng)基優(yōu)化Fig.9 Optimzation of fermentation media

利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進一步發(fā)酵驗證表明，E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE菌株的產(chǎn)量可達到2.3 g/L，相比優(yōu)化前的發(fā)酵結果(1.3 g/L)提升了約77.0%。

3 結論

本文以pA*H質粒為基礎構建了trc啟動子雙表達質粒，發(fā)現(xiàn)提高cysK、glpE和nrdH的表達水平能改善L-甲硫氨酸的產(chǎn)量。以E.coliW3110 JAHFEBL/pA*H為基礎，在基因組上用trc啟動子替換了cysK的本地啟動子，在質粒pA*H上插入glpE和nrdH基因共表達，構建了E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-trc-nrdH-glpE，發(fā)酵48 h的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提升28.2%。以PG3啟動子為模板建立了包含32個樣本的啟動子文庫，強度范圍為11.8%～385.3%。應用p32突變啟動子使重組菌株trc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE的L-甲硫氨酸產(chǎn)量相比trc-cysK/pA*H-nrdH-glpE菌株提升了約12.0%。在此基礎上，硫代硫酸鈉添加量的提升有效彌補了硫通路代謝酶對催化底物的需求，重組菌株E.coliW3110 JAHFEBLtrc-cysK/pA*H-p32-nrdH-glpE發(fā)酵48 h生產(chǎn)的L-甲硫氨酸產(chǎn)量提升了約77.0%。本文通過對硫代謝模塊的優(yōu)化提高了L-甲硫氨酸的產(chǎn)量，同時為其他含硫氨基酸的生物合成提供了研究思路。