輔酶Q10對人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

鄧瑩瑩，丁慰祖

(上海市第八人民醫(yī)院眼科，上海 200235)

輔酶Q10，又名泛醌，是一種類維生素作用物質(zhì)，脂溶性分子，為抗氧化作用非常強(qiáng)的抗氧化劑。輔酶Q10是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，是廣泛存在于生物體內(nèi)的各類細(xì)胞中的一種化合物，在體內(nèi)發(fā)揮著非常重要的作用[1]。研究[2-3]表明，輔酶Q10具有抗氧化作用，能回收利用維生素E，清除體內(nèi)自由基；增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫；對體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞具有一定的殺傷作用；且能夠明顯緩解機(jī)體疲勞，提高運(yùn)動機(jī)能；對心腦血管疾病有預(yù)防和治療作用。近年來，研究[4-5]還發(fā)現(xiàn)輔酶Q10對老年人的視網(wǎng)膜疾病的治療有一定的療效。青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性等多種眼科疾病的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括視網(wǎng)膜衰老、眼壓升高、營養(yǎng)、遺傳、環(huán)境、機(jī)械性損傷、氧化損傷等，而其中的氧化損傷在老年人眼科疾病的發(fā)生中占有非常重要的作用，因而越來越受人們的關(guān)注。然而，輔酶Q10對視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞的作用效果是否為直接作用，以及其可能的作用機(jī)制等問題并未得到全面揭示，這些問題的深入研究將有望為此類疾病的診療提供思路。本研究采用人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)作為研究對象，采用輔酶Q10進(jìn)行干預(yù)，使用藥物梯度實(shí)驗(yàn)明確Q10對RPE是否具有保護(hù)性作用，并采用分子免疫學(xué)等技術(shù)從細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷、凋亡等角度分析輔酶Q10的可能作用機(jī)制，為輔酶Q10對老年人眼科疾病的預(yù)防與治療提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞處理

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株RPE-19(購自中山大學(xué)眼科中心)置于37 ℃培養(yǎng)箱(5% CO2)中，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4組，氧化應(yīng)激模型組，細(xì)胞在200 μmol/L的H2O2溶液中培養(yǎng)2 h；試驗(yàn)組分為兩組，10 μmol/L輔酶Q10組、1 μmol/L輔酶Q10組，兩組細(xì)胞分別經(jīng)10 μmol/L、1 μmol/L輔酶Q10培養(yǎng)48 h后，繼續(xù)在200 μmol/L的H2O2溶液中培養(yǎng)2 h；正常對照組細(xì)胞，不加輔酶Q10和H2O2處理。

1.2 細(xì)胞活性檢測

細(xì)胞活性檢測采用CCK-8法進(jìn)行，在4組細(xì)胞中加入10%CCK-8工作液，同時設(shè)立對照組，然后置于培養(yǎng)箱中孵育30 min，在450 nm波長下利用酶標(biāo)儀測定每孔的OD值，每組設(shè)6復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測

細(xì)胞內(nèi)活性氧采用DCFH-DA熒光探針檢測法進(jìn)行，4組細(xì)胞用DCFH-DA活性氧熒光檢測試劑盒(購自蘇州碧云天生物公司)檢測ROS表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞中 Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的檢測

采用Western blot法檢測細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表達(dá)，提取經(jīng)過不同處理的4組細(xì)胞蛋白質(zhì)，應(yīng)用BCA法測定蛋白濃度。將各組蛋白樣品進(jìn)行電泳分離，同時加入蛋白Marker，進(jìn)行軟膜，脫脂奶粉封閉，順序加入一抗、二抗，曝光，膠片掃描，用Image J 軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 輔酶Q10對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE-19活性的影響

H2O2處理后的細(xì)胞的活性明顯下降，且均低于正常對照組(P<0.05)。經(jīng)輔酶Q10預(yù)處理的細(xì)胞，其細(xì)胞活性明顯高于單純用H2O2處理的模型組細(xì)胞，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組與氧化應(yīng)激模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 輔酶Q10對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE-19活性的影響

*P<0.05，與正常對照組比較；#P<0.05，與氧化應(yīng)激模型組比較。

2.2 輔酶Q10對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE-19活性氧的影響

H2O2處理后的細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量明顯增高，且高于正常對照組(P<0.05)。經(jīng)輔酶Q10預(yù)處理的細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平明顯低于單純用H2O2處理的模型組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組與氧化應(yīng)激模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 輔酶Q10對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞RPE-19活性氧的影響

*P<0.05，與正常對照組比較；#P<0.05，與氧化應(yīng)激模型組比較。

2.3 輔酶Q10對人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、磷酸化-Akt、Akt的表達(dá)影響

輔酶Q10能夠抑制H2O2誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Caspase-3、Bax的表達(dá)，促進(jìn)可以抑制凋亡的Bcl-2的表達(dá)，H2O2可以使細(xì)胞中的Caspase-3、Bax的表達(dá)量升高，且抑制Bcl-2的表達(dá)。與氧化應(yīng)激模型組比較，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組細(xì)胞中Caspase-3、Bax的表達(dá)量低于氧化應(yīng)激模型組，Bcl-2的表達(dá)量高于氧化應(yīng)激模型組。H2O2還可誘導(dǎo)Akt的磷酸化，1 μmol/L輔酶Q10組和10 μmol/L輔酶Q10組的磷酸化-Akt的表達(dá)量低于氧化應(yīng)激模型組。見圖1。

3 討論

伴隨著社會老齡化的加劇，老年性眼病呈現(xiàn)高發(fā)的趨勢，與年齡相關(guān)性黃斑變性、青光眼、白內(nèi)障等多種眼病均引起嚴(yán)重的視力障礙，嚴(yán)重者會導(dǎo)致患者永久失明[6-8]。而引起這些眼部疾病的最重要的一個因素就是氧化應(yīng)激，如果能夠預(yù)防和治療氧化應(yīng)激，對于控制這些眼部疾病的發(fā)生和治療均具有非常重要的意義。

輔酶Q10是生物體內(nèi)的一種抗氧化劑物質(zhì)，天然存在于機(jī)體內(nèi)，已在臨床上廣泛地應(yīng)用于許多疾病的預(yù)防和治療[9-11]。輔酶Q10在體內(nèi)各種組織和器官中的含量隨著年齡的增長而降低，因此其生理作用能力相應(yīng)的下降，與多種慢性疾病的發(fā)生均有關(guān)系。通過外源補(bǔ)充輔酶Q10可以提高其在體內(nèi)的水平，有助于其在體內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，預(yù)防一些慢性疾病的發(fā)生[12-13]。

關(guān)于輔酶Q10在眼部疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用研究較少，本研究應(yīng)用輔酶Q10預(yù)處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，然后用H2O2誘導(dǎo)氧化損傷，探討輔酶Q10對人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究。結(jié)果表明，輔酶Q10能夠增強(qiáng)H2O2處理后的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的活性；降低由于H2O2引起的細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。臨床上多種眼科疾病與視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激密切相關(guān)，如老年性白內(nèi)障、糖尿病視網(wǎng)膜病變等，輔酶Q10抗上皮氧化作用提示具有潛在的臨床應(yīng)用價值。同時，本研究顯示輔酶Q10具有抑制人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Caspase-3、Bax的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平的作用。輔酶Q10體外干預(yù)具有抑制視網(wǎng)膜上皮凋亡的效果，這可能是其療效機(jī)制之一。而Akt是調(diào)控凋亡的重要信號，輔酶Q10干預(yù)顯著抑制了人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，提示輔酶Q的可能作用機(jī)制為抑制Akt信號。

綜上，本研究采用體外研究的方法，證實(shí)了輔酶Q10對人RPE細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制。這可能是通過細(xì)胞發(fā)生氧化損傷，抑制與凋亡發(fā)生相關(guān)因子的表達(dá)(如caspase-3、Bax等)，促進(jìn)凋亡抑制因子Bcl-2表達(dá)，抑制Akt發(fā)生磷酸化等多個方面起作用。