溫度和時(shí)間對(duì)臨床應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)距離運(yùn)輸?shù)挠绊?/h1>
2019-11-07 07:24:46蘇鴻君鄧雯馮佩蘇春燕楊潔文
智慧健康 2019年28期
蘇鴻君，鄧雯，馮佩，蘇春燕，楊潔文
（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 生物治療中心，廣東 廣州 510120）
0 引言
間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力的成體干細(xì)胞，源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，存在于人體發(fā)育過(guò)程的多種組織，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。1976 年，F(xiàn)reidenstein首次發(fā)現(xiàn)在骨髓里存在一群不純的細(xì)胞，這群細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)和成纖維細(xì)胞類(lèi)似，呈克隆性生長(zhǎng)，并提出了“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞”的概念[1]。根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，目前已建立了骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定的實(shí)驗(yàn)方法，其中以骨髓組織中含量最為豐富。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有強(qiáng)大的增殖能力，同時(shí)也具有多向分化潛能。在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，MSC 不僅可分化為造血細(xì)胞，還具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能[2]。MSC 可以用于細(xì)胞療法治療骨骼和心血管缺陷以及其他各種退化性疾病和組織損傷[3]，MSC 也可以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)用于各種臨床試驗(yàn)比如移植物宿主免疫反應(yīng)和其他自身免疫性疾病[4]。
人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增至10 代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，并高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45、CD14。Cai 等發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增第1 代至第8 代期間MSC 生長(zhǎng)速度很快，以指數(shù)形式快速增值，且MSC基因組沒(méi)有顯著的改變，僅有一些很低水平的單核苷酸的變化（single-nucleotide change，SNC），僅占0.1 %-1 %；第8 代以后，擴(kuò)增速度明顯降低。第10代到第13代，細(xì)胞體積開(kāi)始增大，核/質(zhì)比變大，但是細(xì)胞的分化潛能從第1 到第13 代幾乎沒(méi)有變化。但是在第13 代的時(shí)候，顯著地出現(xiàn)了677 個(gè)單核苷酸的突變，17 %-36 %的MSC 出現(xiàn)了突變。而且這些突變導(dǎo)致了非同義氨基酸的突變，引發(fā)了一些基因（如NOTCH1、ZFP64、SMARCA2、KIAA2018、DCAF8L1 等）的突變。而且他們發(fā)現(xiàn)這些基因與成骨分化、骨代謝、腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞干性的保持等功能相關(guān)[5]。說(shuō)明MSC 在體外擴(kuò)增的過(guò)程中，如果代數(shù)超過(guò)12 代，就會(huì)引起MSC 產(chǎn)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。體外擴(kuò)增的MSC在臨床應(yīng)用上的應(yīng)用最好限制在12代以?xún)?nèi)。
但是能制備間充質(zhì)干細(xì)胞的醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須具備GMP 合格的千級(jí)細(xì)胞層流房，這樣的醫(yī)療機(jī)構(gòu)畢竟是少數(shù)，所以臨床上間充質(zhì)干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用必須解決一個(gè)遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題。一般制備成功的間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)途外送過(guò)程中會(huì)遇到以下問(wèn)題：（1）液氮凍存的細(xì)胞外送：不能上飛機(jī)、高鐵，若選擇汽車(chē)，運(yùn)輸時(shí)間超過(guò)12 小時(shí)以上液氮會(huì)完全揮發(fā)，凍存的細(xì)胞會(huì)升溫死亡；（2）新鮮培養(yǎng)液加至滿(mǎn)瓶后置于冰盒中外送：上飛機(jī)須托運(yùn)，總時(shí)間長(zhǎng)于5 小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液PH 值會(huì)升高，影響細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，影響細(xì)胞分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力，而且細(xì)胞受污染的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)升高；（3）貼壁細(xì)胞用胰酶消化清洗后注射入生理鹽水瓶中懸浮密封低溫外送：即使隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率會(huì)降低。生理鹽水外送的細(xì)胞可以直接注射，可以解決一些地區(qū)不具備復(fù)蘇細(xì)胞和處理貼壁細(xì)胞的條件的問(wèn)題，而且密封性好污染風(fēng)險(xiǎn)低。但是最佳的外送溫度和時(shí)間限制的條件不明確，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為例，測(cè)量不同溫度和時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響[6]。
1 方法
1.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
髂后上棘抽取骨髓10-15 mL，加入等體積生理鹽水混勻。在15 mL 離心管中加入與骨髓等體積的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的骨髓緩慢加入淋巴分離液液面上，水平離心機(jī)常溫下以1500 r/min 的速度離心20 分鐘。從界面上取出的白色的細(xì)胞層后用生理鹽水洗滌2～3 次后，加適量培養(yǎng)液計(jì)數(shù)。按5～8×106/mL 濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶含16 mL L-DMEM 完全培養(yǎng)液。在5 %的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，第3 天半量換液1 次，第6 天全換液，以后每3 天半量換液1 次，第10～12 天細(xì)胞達(dá)到90 %融合時(shí)傳代。傳代時(shí)先倒掉全部培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS 緩沖液洗滌二次，加入37 ℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶（含1 mmol/L EDTA）0.5 mL消化2～5 分鐘，貼壁細(xì)胞層開(kāi)始脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)液5mL 終止胰酶作用。吸管反復(fù)吹打后將細(xì)胞收集于15 mL 離心管中，1500 r/min 離心10 分鐘后棄上清，將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)后按1～2×106/瓶的密度接種于新的75 cm2培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)按1 比2 或1 比3 的比例傳至3～4 代，即可得到純化的人骨髓MSC，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。
1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
將第4 代的MSC 用胰酶消化后，用完全培養(yǎng)液終止后，離心洗滌2 次，用生理鹽水重懸細(xì)胞濃度至1×106/mL。每一個(gè)需要檢測(cè)的細(xì)胞表面標(biāo)記抗原設(shè)置2 支流式管，每一支流式管加入100 ul 的細(xì)胞懸液，再分別加入1 test 的同型對(duì)照抗體和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)志抗原流式熒光抗體。人骨髓MSC 需要檢測(cè)CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLADR 等7 個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記抗原的表達(dá)情況。同時(shí)，將每一個(gè)MSC 取3×105，種入12 孔板三個(gè)孔中，每孔加入1×105，分別加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，進(jìn)行MSC分化能力鑒定。
1.3 存活率的測(cè)定
第4 代的MSC 用胰酶消化并終止后，離心洗滌4次，用生理鹽水重懸至預(yù)估濃度范圍為0.1-10×106/mL，吸取5 ul 細(xì)胞懸液和5 ul 臺(tái)盼藍(lán)染色液，混合均勻后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2 結(jié)果
2.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
淋巴細(xì)胞分離液分離后的骨髓細(xì)胞在37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)后第6-9 天，出現(xiàn)細(xì)胞克隆集落（圖1），繼續(xù)培養(yǎng)至10-12 天后可傳代，培養(yǎng)30-35 天后傳代至第4 代，可以得到較為純凈的人骨髓MSC（圖2）。
圖1 人骨髓MSC P0 代細(xì)胞
2.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
將6 個(gè)MSC 的第4 代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記抗原流式鑒定，所有細(xì)胞CD73,CD90 和CD105 陽(yáng)性表達(dá)達(dá)到95 %以上，CD14,CD34,CD45,HLA-DR 皆幾乎不表達(dá)，表達(dá)率在0-1 %，圖3 所示為其中一個(gè)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記抗原的表達(dá)情況。6 個(gè)細(xì)胞皆可以進(jìn)行成骨、成脂和成軟骨分化，圖4 中a，b 和c 分別顯示成骨、成脂和成軟骨分化陽(yáng)性的圖示。
圖3 人骨髓MSC 細(xì)胞表面標(biāo)記抗原表達(dá)情況
圖4 人骨髓MSC 成骨、成脂和成軟骨分化鑒定
2.3 時(shí)間溫度對(duì)生理鹽水中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
將6 個(gè)4 代的人MSC 分別分成5 份裝入100 mL密封生理鹽水袋中，分別放入盛冰水混合物的保溫盒（0 ℃）、4 ℃恒溫車(chē)載小型冰箱、裝有預(yù)先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）、常溫保溫盒（25 ℃左右）和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（對(duì)照）。將上述30 份細(xì)胞分別在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0 h,2 h,4 h,6 h,8 h 和24 h）用無(wú)菌1 mL 注射器抽取少量細(xì)胞進(jìn)行存活率檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)只有4 ℃恒溫保存的細(xì)胞保持存活率在90 %上的時(shí)間最長(zhǎng)，可以達(dá)到6 小時(shí)，其次是放入裝有預(yù)先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）的細(xì)胞，可以達(dá)到2 小時(shí)（表1）。繪制成折線(xiàn)圖后發(fā)現(xiàn)4 ℃恒溫保存的方法細(xì)胞存活率在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都最高（圖5）。
圖5 時(shí)間和溫度對(duì)人骨髓MSC 存活率的影響
表1 6 個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(第4 代)制備后重懸于生理鹽水中后時(shí)間和溫度對(duì)存活率的影響
3 討論
隨著干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，干細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)途運(yùn)輸勢(shì)必會(huì)越來(lái)越頻繁。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在4 ℃的恒溫保溫箱中保持細(xì)胞良好活性（存活率90 %以上）的時(shí)間最長(zhǎng)，可以達(dá)到6 小時(shí)。隨著高鐵、飛機(jī)等快捷交通工具的應(yīng)用，這個(gè)保存條件基本可以滿(mǎn)足干細(xì)胞遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)囊?。而且隨著干細(xì)胞多中心的建立，跨省的干細(xì)胞運(yùn)輸會(huì)越來(lái)越少，遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)木嚯x會(huì)越來(lái)越短，所需時(shí)間也會(huì)越來(lái)越短。從圖5，我們可以看出細(xì)胞在缺失營(yíng)養(yǎng)的條件下，溫度越低細(xì)胞活性越好，這可能與低溫條件下細(xì)胞的代謝速率降低有關(guān)[7-10]。4 ℃恒溫條件下細(xì)胞活性最好的原因，可能與水在4 ℃時(shí)密度最大有關(guān)。而處于冰水混合物條件（0 ℃）下細(xì)胞的存活率比8-17 ℃還低，可能是因?yàn)樗m然在0 ℃時(shí)結(jié)冰，但水在0 ℃以下，也可以保持液體狀態(tài)，稱(chēng)為過(guò)冷卻水，冰水混合物中的液態(tài)水中存在溫度低于0 ℃的過(guò)冷卻水。冰水混合物條件下的部分細(xì)胞溫度可能低于0 ℃，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生了結(jié)晶，在沒(méi)有細(xì)胞保護(hù)液的條件下，細(xì)胞會(huì)受到傷害，細(xì)胞活性就會(huì)降低。而且0 ℃的條件也很難保持，時(shí)間長(zhǎng)看冰水混合物中冰會(huì)融化，而將溫度調(diào)節(jié)至0 ℃的小型冰箱也容易結(jié)冰。因此，4 ℃才是活細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖罴褱囟葪l件。隨著技術(shù)的進(jìn)步，如果出現(xiàn)一種安全無(wú)害且可以直接輸注人體的懸浮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)保存液，保存時(shí)間將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)6 小時(shí)。
蘇鴻君，鄧雯，馮佩，蘇春燕，楊潔文
（中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 生物治療中心，廣東 廣州 510120）
0 引言
間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有多向分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力的成體干細(xì)胞，源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，存在于人體發(fā)育過(guò)程的多種組織，主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。1976 年，F(xiàn)reidenstein首次發(fā)現(xiàn)在骨髓里存在一群不純的細(xì)胞，這群細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)和成纖維細(xì)胞類(lèi)似，呈克隆性生長(zhǎng)，并提出了“骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞”的概念[1]。根據(jù)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性，目前已建立了骨髓、脂肪、臍血、臍帶等多種組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定的實(shí)驗(yàn)方法，其中以骨髓組織中含量最為豐富。間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有強(qiáng)大的增殖能力，同時(shí)也具有多向分化潛能。在適宜的體內(nèi)或體外環(huán)境下，MSC 不僅可分化為造血細(xì)胞，還具有分化為肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞的潛能[2]。MSC 可以用于細(xì)胞療法治療骨骼和心血管缺陷以及其他各種退化性疾病和組織損傷[3]，MSC 也可以調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)用于各種臨床試驗(yàn)比如移植物宿主免疫反應(yīng)和其他自身免疫性疾病[4]。
人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增至10 代，細(xì)胞形態(tài)不發(fā)生明顯改變，并高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105，不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45、CD14。Cai 等發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增第1 代至第8 代期間MSC 生長(zhǎng)速度很快，以指數(shù)形式快速增值，且MSC基因組沒(méi)有顯著的改變，僅有一些很低水平的單核苷酸的變化（single-nucleotide change，SNC），僅占0.1 %-1 %；第8 代以后，擴(kuò)增速度明顯降低。第10代到第13代，細(xì)胞體積開(kāi)始增大，核/質(zhì)比變大，但是細(xì)胞的分化潛能從第1 到第13 代幾乎沒(méi)有變化。但是在第13 代的時(shí)候，顯著地出現(xiàn)了677 個(gè)單核苷酸的突變，17 %-36 %的MSC 出現(xiàn)了突變。而且這些突變導(dǎo)致了非同義氨基酸的突變，引發(fā)了一些基因（如NOTCH1、ZFP64、SMARCA2、KIAA2018、DCAF8L1 等）的突變。而且他們發(fā)現(xiàn)這些基因與成骨分化、骨代謝、腫瘤發(fā)生、干細(xì)胞干性的保持等功能相關(guān)[5]。說(shuō)明MSC 在體外擴(kuò)增的過(guò)程中，如果代數(shù)超過(guò)12 代，就會(huì)引起MSC 產(chǎn)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。體外擴(kuò)增的MSC在臨床應(yīng)用上的應(yīng)用最好限制在12代以?xún)?nèi)。
但是能制備間充質(zhì)干細(xì)胞的醫(yī)療機(jī)構(gòu)必須具備GMP 合格的千級(jí)細(xì)胞層流房，這樣的醫(yī)療機(jī)構(gòu)畢竟是少數(shù)，所以臨床上間充質(zhì)干細(xì)胞的廣泛應(yīng)用必須解決一個(gè)遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)膯?wèn)題。一般制備成功的間充質(zhì)干細(xì)胞長(zhǎng)途外送過(guò)程中會(huì)遇到以下問(wèn)題：（1）液氮凍存的細(xì)胞外送：不能上飛機(jī)、高鐵，若選擇汽車(chē)，運(yùn)輸時(shí)間超過(guò)12 小時(shí)以上液氮會(huì)完全揮發(fā)，凍存的細(xì)胞會(huì)升溫死亡；（2）新鮮培養(yǎng)液加至滿(mǎn)瓶后置于冰盒中外送：上飛機(jī)須托運(yùn)，總時(shí)間長(zhǎng)于5 小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液PH 值會(huì)升高，影響細(xì)胞狀態(tài)，細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，影響細(xì)胞分化潛能和免疫調(diào)節(jié)能力，而且細(xì)胞受污染的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)升高；（3）貼壁細(xì)胞用胰酶消化清洗后注射入生理鹽水瓶中懸浮密封低溫外送：即使隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率會(huì)降低。生理鹽水外送的細(xì)胞可以直接注射，可以解決一些地區(qū)不具備復(fù)蘇細(xì)胞和處理貼壁細(xì)胞的條件的問(wèn)題，而且密封性好污染風(fēng)險(xiǎn)低。但是最佳的外送溫度和時(shí)間限制的條件不明確，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為例，測(cè)量不同溫度和時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響[6]。
1 方法
1.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
髂后上棘抽取骨髓10-15 mL，加入等體積生理鹽水混勻。在15 mL 離心管中加入與骨髓等體積的淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋的骨髓緩慢加入淋巴分離液液面上，水平離心機(jī)常溫下以1500 r/min 的速度離心20 分鐘。從界面上取出的白色的細(xì)胞層后用生理鹽水洗滌2～3 次后，加適量培養(yǎng)液計(jì)數(shù)。按5～8×106/mL 濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶含16 mL L-DMEM 完全培養(yǎng)液。在5 %的CO2和37 ℃的培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)，第3 天半量換液1 次，第6 天全換液，以后每3 天半量換液1 次，第10～12 天細(xì)胞達(dá)到90 %融合時(shí)傳代。傳代時(shí)先倒掉全部培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS 緩沖液洗滌二次，加入37 ℃預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶（含1 mmol/L EDTA）0.5 mL消化2～5 分鐘，貼壁細(xì)胞層開(kāi)始脫落時(shí)，加入完全培養(yǎng)液5mL 終止胰酶作用。吸管反復(fù)吹打后將細(xì)胞收集于15 mL 離心管中，1500 r/min 離心10 分鐘后棄上清，將細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)后按1～2×106/瓶的密度接種于新的75 cm2培養(yǎng)瓶中。繼續(xù)按1 比2 或1 比3 的比例傳至3～4 代，即可得到純化的人骨髓MSC，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。
1.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
將第4 代的MSC 用胰酶消化后，用完全培養(yǎng)液終止后，離心洗滌2 次，用生理鹽水重懸細(xì)胞濃度至1×106/mL。每一個(gè)需要檢測(cè)的細(xì)胞表面標(biāo)記抗原設(shè)置2 支流式管，每一支流式管加入100 ul 的細(xì)胞懸液，再分別加入1 test 的同型對(duì)照抗體和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞表面標(biāo)志抗原流式熒光抗體。人骨髓MSC 需要檢測(cè)CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、CD14、HLADR 等7 個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記抗原的表達(dá)情況。同時(shí)，將每一個(gè)MSC 取3×105，種入12 孔板三個(gè)孔中，每孔加入1×105，分別加入成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基和成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，進(jìn)行MSC分化能力鑒定。
1.3 存活率的測(cè)定
第4 代的MSC 用胰酶消化并終止后，離心洗滌4次，用生理鹽水重懸至預(yù)估濃度范圍為0.1-10×106/mL，吸取5 ul 細(xì)胞懸液和5 ul 臺(tái)盼藍(lán)染色液，混合均勻后加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2 結(jié)果
2.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的制備
淋巴細(xì)胞分離液分離后的骨髓細(xì)胞在37 ℃的5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)后第6-9 天，出現(xiàn)細(xì)胞克隆集落（圖1），繼續(xù)培養(yǎng)至10-12 天后可傳代，培養(yǎng)30-35 天后傳代至第4 代，可以得到較為純凈的人骨髓MSC（圖2）。
圖1 人骨髓MSC P0 代細(xì)胞
2.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
將6 個(gè)MSC 的第4 代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)記抗原流式鑒定，所有細(xì)胞CD73,CD90 和CD105 陽(yáng)性表達(dá)達(dá)到95 %以上，CD14,CD34,CD45,HLA-DR 皆幾乎不表達(dá)，表達(dá)率在0-1 %，圖3 所示為其中一個(gè)MSC細(xì)胞表面標(biāo)記抗原的表達(dá)情況。6 個(gè)細(xì)胞皆可以進(jìn)行成骨、成脂和成軟骨分化，圖4 中a，b 和c 分別顯示成骨、成脂和成軟骨分化陽(yáng)性的圖示。
圖3 人骨髓MSC 細(xì)胞表面標(biāo)記抗原表達(dá)情況
圖4 人骨髓MSC 成骨、成脂和成軟骨分化鑒定
2.3 時(shí)間溫度對(duì)生理鹽水中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的影響
將6 個(gè)4 代的人MSC 分別分成5 份裝入100 mL密封生理鹽水袋中，分別放入盛冰水混合物的保溫盒（0 ℃）、4 ℃恒溫車(chē)載小型冰箱、裝有預(yù)先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）、常溫保溫盒（25 ℃左右）和37 ℃恒溫培養(yǎng)箱（對(duì)照）。將上述30 份細(xì)胞分別在6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（0 h,2 h,4 h,6 h,8 h 和24 h）用無(wú)菌1 mL 注射器抽取少量細(xì)胞進(jìn)行存活率檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)只有4 ℃恒溫保存的細(xì)胞保持存活率在90 %上的時(shí)間最長(zhǎng)，可以達(dá)到6 小時(shí)，其次是放入裝有預(yù)先冷凍冰袋的保溫盒（8-17 ℃）的細(xì)胞，可以達(dá)到2 小時(shí)（表1）。繪制成折線(xiàn)圖后發(fā)現(xiàn)4 ℃恒溫保存的方法細(xì)胞存活率在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)都最高（圖5）。
圖5 時(shí)間和溫度對(duì)人骨髓MSC 存活率的影響
表1 6 個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(第4 代)制備后重懸于生理鹽水中后時(shí)間和溫度對(duì)存活率的影響
3 討論
隨著干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，干細(xì)胞進(jìn)行遠(yuǎn)途運(yùn)輸勢(shì)必會(huì)越來(lái)越頻繁。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在4 ℃的恒溫保溫箱中保持細(xì)胞良好活性（存活率90 %以上）的時(shí)間最長(zhǎng)，可以達(dá)到6 小時(shí)。隨著高鐵、飛機(jī)等快捷交通工具的應(yīng)用，這個(gè)保存條件基本可以滿(mǎn)足干細(xì)胞遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)囊?。而且隨著干細(xì)胞多中心的建立，跨省的干細(xì)胞運(yùn)輸會(huì)越來(lái)越少，遠(yuǎn)距離運(yùn)輸?shù)木嚯x會(huì)越來(lái)越短，所需時(shí)間也會(huì)越來(lái)越短。從圖5，我們可以看出細(xì)胞在缺失營(yíng)養(yǎng)的條件下，溫度越低細(xì)胞活性越好，這可能與低溫條件下細(xì)胞的代謝速率降低有關(guān)[7-10]。4 ℃恒溫條件下細(xì)胞活性最好的原因，可能與水在4 ℃時(shí)密度最大有關(guān)。而處于冰水混合物條件（0 ℃）下細(xì)胞的存活率比8-17 ℃還低，可能是因?yàn)樗m然在0 ℃時(shí)結(jié)冰，但水在0 ℃以下，也可以保持液體狀態(tài)，稱(chēng)為過(guò)冷卻水，冰水混合物中的液態(tài)水中存在溫度低于0 ℃的過(guò)冷卻水。冰水混合物條件下的部分細(xì)胞溫度可能低于0 ℃，細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生了結(jié)晶，在沒(méi)有細(xì)胞保護(hù)液的條件下，細(xì)胞會(huì)受到傷害，細(xì)胞活性就會(huì)降低。而且0 ℃的條件也很難保持，時(shí)間長(zhǎng)看冰水混合物中冰會(huì)融化，而將溫度調(diào)節(jié)至0 ℃的小型冰箱也容易結(jié)冰。因此，4 ℃才是活細(xì)胞運(yùn)輸?shù)淖罴褱囟葪l件。隨著技術(shù)的進(jìn)步，如果出現(xiàn)一種安全無(wú)害且可以直接輸注人體的懸浮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)保存液，保存時(shí)間將遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)6 小時(shí)。
