缺氧心肌細胞來源外泌體對Gli1+細胞纖維化表型轉換的作用機制

林潮金，秦愛萍，李松沛，霍 然，鄧 賽，傅小媚，向 楊，余細勇

(廣州醫(yī)科大學藥學院、廣東省分子靶標與臨床藥理學重點實驗室、呼吸疾病國家重點實驗室藥理學組，廣東 廣州 511436)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)主要表現(xiàn)為心肌組織中膠原纖維的過量沉積，膠原濃度以及膠原容積分數(shù)增加，各種類型的膠原比例失調而使心臟僵硬、心功能降低[1]。MF與高血壓、糖尿病、風濕性心臟病、肥厚性心肌病等多種心血管疾病密切相關，是心室重構的重要原因，最終演變?yōu)樾牧λソ遊2]。近十年來，干細胞在臨床前或早期臨床試驗中主要顯示出對損傷心臟的修復功能，其在心臟疾病中的潛在治療效果備受關注[3]。但是，心臟干細胞及其微環(huán)境(Niche)調控在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展與防治中的作用尚未清楚。傳統(tǒng)的研究認為，MF是由于成纖維細胞過度增殖，使細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白大量沉積[4]。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，心肌血管周圍的Gli1+間充質干細胞樣的細胞在損傷情況下大量增殖并轉化為活化狀態(tài)的成纖維細胞[5]，但對于這種轉化是否存在旁分泌信號傳導調控尚不清楚。外泌體被認為是細胞旁分泌的重要介質，它所攜帶的內(nèi)容物(蛋白質、脂質、mRNA、非編碼RNA)對多種生物過程起到關鍵的調節(jié)作用[6,7]。盡管心肌細胞(cardiomyocytes，CMs)并非分泌型細胞，但經(jīng)誘導后也可產(chǎn)生大量的外泌體。已有文獻提出，CMs分泌的外泌體通過介導細胞間通訊，對心臟疾病起到促進作用[8]。有研究表明，受損CMs衍生的外泌體加速了梗死心臟移植的骨髓間充質干細胞的損傷[9]。那么，在受損情況下，心臟固有的Gli1+細胞纖維化是否受CMs衍生外泌體的影響，尚未清楚。因此，本研究主要探究缺氧CMs衍生的外泌體及其發(fā)揮關鍵作用的miR-223對Gli1+細胞纖維化的調節(jié)作用。

1 材料

1.1 試劑MSC qualified FBS (Life Technologies)；α-MEM(GlutaMAX，Life Technologies)；鼠堿性成纖維細胞生長因子、鼠表皮生長因子(Peprotech)；CD140a磁珠分選試劑盒、分選緩沖液(MiltenyiBiotec)；Foxp3 /轉錄因子染色緩沖液試劑盒(Invitrogen)；Exo-Quick提取試劑盒(System Bioscience)；抗小鼠CD105-PE、CD29-PE、CD31-FITC、CD34-AF647、CD45-PerCP-Cy5.5(BD Biosciences)；抗小鼠Gli1(Novus)；抗兔IgG-PE(eBioscience)；PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits(Sigma Aldrich)；miRcute miRNA Isolation Kit(TIANGEN)；Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit(TaKaRa)；Lipo3000(Invitrogen)。

1.2 儀器Amnis?Image StreamX MarkII流式細胞儀(德國Merck公司)；Amersham Imager 600成像儀(美國GE公司)；LightCycler? 480 Ⅱ實時熒光定量PCR儀(瑞士Roche公司)；Confocal激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；普通熒光顯微鏡(德國Leica公司)；NanosightNS500 納米粒子分析儀(英國Malveron公司)。

1.3 實驗動物8～9周齡的C57BL/6J小鼠，♂，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證為SCXK(粵)2013-0034，使用許可證為SCXK(粵)2016-0168。

2 方法

2.1 Gli1+細胞的分離與鑒定取♂成年C57BL/6J小鼠，用無菌剪打開胸腔取出心臟，然后置于10 mL D-PBS中清洗3遍，去除心臟里的血跡，再將心臟剪成1 mm3的小塊，加入5 mL質量分數(shù)為0.1%的Collagen II混勻，37 ℃水浴反復搖晃多次，消化并用吸管吹打，直至消化完全，經(jīng)過濾后，濾液用300×g離心5 min使細胞沉淀，加入1 mL分選緩沖液混勻，進行磁珠分選，按照MiltenyiBiotec公司試劑盒說明書操作(Cat.no.130-101-502)，細胞用含有體積分數(shù)為0.1的胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(也稱為α-MEM完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)。

細胞表面抗原的染色：平均取106個細胞置于流式管中，按照1 ∶100的稀釋比例，分別加入1 μL抗小鼠抗體CD105-PE、CD29-PE、CD31-FITC、CD34-AF647和CD45-PerCP-Cy5.5混勻，然后室溫避光孵育0.5 h，用PBS洗1遍，300×g離心5 min，棄上清，每管加入50 μL體積分數(shù)為0.04的多聚甲醛混勻，轉移到1.5 mL的離心管中，用流式細胞儀進行檢測。細胞內(nèi)抗原Gli1的染色：將細胞進行固定、透化30 min后，用含質量分數(shù)為2%的BSA封閉15 min(可選)，再加入Gli1一抗(1 ∶1 000)混勻，置于室溫孵育30 min，用1 mL PBS洗2次，300×g離心5 min，棄上清，然后加入PE(1 ∶1 000)標記的熒光二抗混勻，再室溫避光孵育30 min，用1 mL PBS洗2次，300×g離心5 min，棄上清，加入50 μL體積分數(shù)為0.04的多聚甲醛混勻，轉移至1.5 mL的離心管中，用流式細胞儀進行檢測。

2.2 SD乳鼠心肌細胞的分離、培養(yǎng)與鑒定1～3 d SD乳鼠用體積分數(shù)為0.75的酒精消毒后，放入超凈臺，用無菌直剪打開胸腔，輕輕用力迅速擠壓乳鼠背部，暴露心臟，用彎鑷夾取心臟，放入裝有適量預冷的HBSS液中晃洗3次，再將心臟放入培養(yǎng)皿，去除心耳以及動脈，用彎剪剪成糊狀，加入10 mL質量分數(shù)為0.05%胰酶消化13 h，加入2 mL FBS替代等量的原消化液來停止消化，再加入Collagen II使其最終質量分數(shù)為0.1%，37 ℃水浴反復晃動消化15 min，吸管吹打幾次，用220目篩網(wǎng)過濾到等體積的L15培養(yǎng)基中，300×g離心5 min，去上清，加入高糖DMEM完全培養(yǎng)基制備成單細胞懸液，置于培養(yǎng)皿中差速貼壁0.5 h，吸上清300×g離心5 min，再加入含有20 mmol·L-15-溴脫氧尿嘧啶核苷的高糖DMEM完全培養(yǎng)基吹打均勻進行培養(yǎng)。

心肌細胞的鑒定：將原代貼壁生長且搏動的心肌細胞用質量分數(shù)為0.25%的胰酶消化，傳至24孔板中，待細胞貼壁后，去掉培養(yǎng)基，用PBS洗2遍，然后將細胞固定、透化0.5 h，用質量分數(shù)為2%的BSA封閉15 min，再加入心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)和α-輔肌動蛋白(α-Actinin)一抗(1 ∶50稀釋)，4 ℃孵育過夜，用PBS清洗2遍，加入熒光二抗(1 ∶1 000稀釋)，置于室溫避光孵育0.5 h，用PBS洗2遍，加入DAPI(1 ∶500稀釋)，再室溫避光孵育5 min，用PBS洗3遍，滴加抗熒光淬滅劑，即可放在熒光顯微鏡下檢測。

2.3 外泌體的提取與鑒定將心肌細胞分為正常條件培養(yǎng)組與缺氧條件培養(yǎng)組，分別換成高糖DMEM與無糖DMEM，均不含胎牛血清，經(jīng)48 h后收集上清，提取正常心肌細胞來源的外泌體(normal CMs-derived exosomes，N-exo)和缺氧處理心肌細胞來源的外泌體(hypoxia-treated CMs-derived exosomes，H-exo)。按照外泌體提取試劑盒說明操作，上清 ∶提取液=5 ∶1的比例加入外泌體提取試劑，上下翻轉混勻，4 ℃靜置12 h以上，然后1 500×g離心0.5 h，吸出大部分上清，再1 500×g離心5 min，所得沉淀即為外泌體，加入100 μL PBS重懸，取15 μL用于濃度檢測，其余可放置-80 ℃保存。

外泌體的鑒定：往外泌體溶液中加入適量5× loading buffer，95 ℃水浴煮5 min，再經(jīng)電泳、轉膜、封閉、孵一抗(1 ∶1 000稀釋，4 ℃過夜)、TBST清洗、孵二抗(1 ∶5 000稀釋，室溫孵育1 h)、TBST清洗，滴加適量發(fā)光液，最后用Amersham Imager 600成像儀自動曝光拍照。另外，用Nanosight進行外泌體粒徑以及濃度分析，一定量外泌體加入PBS液稀釋至1 mL，加入樣品槽后自動上樣并生成實驗報告。用電鏡對外泌體大小形態(tài)進行分析。

2.4 外泌體攝取實驗使用PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kits對外泌體進行標記，按照試劑盒(Cat.no.MINI26-1KT)說明書操作，用1 mL的Diluent C溶液重懸外泌體沉淀，往其中快速加入1 mL含PKH26的Diluent C混勻，室溫放置5 min，再加入等量的FBS終止反應，100 000×g離心70 min，去除沒有與外泌體結合的PKH26，沉淀用α-MEM完全培養(yǎng)基重懸后，加入Gli1+細胞中培養(yǎng)24 h。用共聚焦熒光顯微鏡檢測細胞對外泌體的攝取情況。

2.5 外泌體與Gli1+細胞共培養(yǎng)為探究缺氧心肌細胞上清提取的外泌體對Gli1+細胞纖維化的影響，設置陰性對照組、正常外泌體組(N-exo)、缺氧外泌體組(H-exo)，以及TGF-β(100 μg·L-1)陽性對照組。按照1×1014particles·L-1的濃度將外泌體加入到Gli1+細胞中培養(yǎng)48 h，收集細胞并進行裂解與變性，用Western blot分析細胞中纖維化蛋白的表達情況(如“2.3”所述)。

2.6 外泌體中miRs的差異分析將“2.3”中提取到的兩種外泌體樣本，按照miRcute miRNA Isolation Kit操作說明提取外泌體中總miRs后，使用Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis Kit 進行逆轉錄，嘗試擴增5個相關miRs，比較其在N-exo與H-exo中的差異表達。

2.7 Gli1+細胞轉染miR-223 mimic和inhibitor待6孔板中的Gli1+細胞匯合至50%后，按照Lipo3000操作說明轉染miR-223 mimic、inhibitor以及相應的negative control(NC)。操作步驟如下：250 μL opti-MEM中加入5 μL 25 pmol mimic，輕微地混勻，室溫放置5 min，再將稀釋的mimic與稀釋的Lipo3000混勻，室溫放置20 min，(inhibitor、NC以及Lipo3000的稀釋方法同上)，最后將混合液與1.5 mL opti-MEM培養(yǎng)基混勻再加入到細胞中，12 h后更換為α-MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，提取細胞蛋白后用Western blot分析(如“2.3”所述)。

3 結果

3.1 Gli1+細胞與心肌細胞的形態(tài)鑒定磁珠分選法獲得的原代Gli1+細胞，培養(yǎng)于含體積分數(shù)為0.1胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基中，細胞貼壁生長后，形態(tài)為長梭形成纖維細胞樣(Fig 1A)。用流式細胞儀進行鑒定，結果顯示，細胞強陽性表達間充質干細胞標記CD29、CD105和Gli1，基本不表達內(nèi)皮細胞標記CD31、造血干細胞標記CD34和淋巴細胞標記CD45(Fig 1B)。表明所分選的Gli1+細胞純度高，可以用于后續(xù)實驗。

差速貼壁法提取的心肌細胞，培養(yǎng)至d 3后，細胞呈現(xiàn)一致性的搏動，將細胞傳至24孔板中，用免疫熒光法鑒定。結果顯示，心肌細胞陽性表達cTnT和α-Actinin(Fig 1C)，符合后續(xù)實驗要求。

Fig 1 Identification of Gli1+cells and cardiomyocytes

A:Morphology of isolated Gli1+cells in day 5 (scale bar=200 μm); B:Expression of Gli1,CD29,CD105,CD31,CD34 and CD45 in Gli1+cells were detected by flow cytometry (negative control in black,Gli1+cells in white); C:Expression of cTnT and α-Actinin in cardiomyocytes were examined by immunofluorescence (scale bar=100 μm).

Fig 2 Characteristics of cardiomyocyte-derived exosomes

A:Exosomes markers Flotillin-1,Alix,HSP70 and CD63 were measured by Western blot; B:Electron microscopy analysis of exosomes secreted by cardiomyocytes (scale bar=200 nm); C:Expression of CD63 in exosomes and morphology of exosomes were detected by flow cytometry; D:Sizes of exosomes were detected by nanoparticle tracking analysis (NTA) (mode:127 nm).

3.2 心肌細胞外泌體特性分析分別從正常和缺氧條件培養(yǎng)的心肌細胞獲得的培養(yǎng)基中提取外泌體(N-exo、H-exo)，Western blot結果顯示，N-exo和H-exo均陽性表達Flotillin-1、Alix、HSP70以及CD63(Fig 2A)。電鏡結果顯示，外泌體呈“杯型”或“碟狀”形態(tài)，大小在100 nm左右(Fig 2B)。流式結果也顯示，外泌體陽性表達CD63(Fig 2C)。以上結果提示，心肌細胞上清外泌體成功提取。

3.3 外泌體攝取實驗將外泌體與PKH26紅色熒光標記染料結合使之帶上紅色熒光，再與Gli1+細胞共培養(yǎng)12 h，用Hoechst 33342染料對細胞核染色，置于共聚焦熒光顯微鏡下觀察，可見帶熒光的外泌體被細胞內(nèi)吞，此時主要聚集在細胞核周圍(Fig 3)。

3.4 H-exo促進Gli1+細胞纖維化蛋白質印跡法結果顯示，相比于陰性對照組，與H-exo共培養(yǎng)或者TGF-β(100 μg·L-1)處理組的Gli1+細胞明顯增加纖維化相關蛋白α-SMA、DDR-2和Collagen I的表達(Fig 4A，4B)。流式檢測陰性對照組與H-exo處理組，結果顯示H-exo處理后，Gli1+細胞中α-SMA與DDR-2雙陽性表達的細胞數(shù)由27.5%上調為60.3%(Fig 4C)。以上兩種實驗結果均提示，H-exo可以促進Gli1+細胞纖維化。

Fig 3 Gli1+cells internalization

3.5 miR-223促進Gli1+細胞纖維化RT-qPCR分析N-exo與H-exo中與細胞纖維化相關的microRNAs的差異表達，發(fā)現(xiàn)miR-223在H-exo中的表達量明顯上調(Fig 5A)。流式檢測陰性對照組與miR-223的模擬物(mimic)處理組，結果顯示miR-223 mimic處理后，Gli1+細胞中α-SMA與DDR-2雙陽性表達的細胞數(shù)由27.6%上調為88.3%(Fig 5B)。Western blot檢測纖維化相關蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)，miR-223 mimic(50 nmol·L-1)處理組細胞中α-SMA、DDR-2和Collagen I的表達量明顯上升(Fig 5C,5D)，提示miR-223可能促進Gli1+細胞纖維化。

Fig 4 The fibrotic effect of hypoxic exosomes on Gli1+cells

4 討論

多年來，心臟纖維化的細胞起源一直不清楚，Weber等[10]研究表明，心臟纖維化可能涉及血管周圍細胞。傳統(tǒng)理論認為，心外膜細胞通過上皮-間質轉化后形成成纖維細胞，損傷引發(fā)的上皮-間質轉化失調可導致心臟纖維化[11]。而在壓力超負荷引起的心臟病變中，大部分成纖維細胞來源于病理誘導的內(nèi)皮-間質轉化[12-13]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，心肌血管周圍的間充質細胞樣Gli1+細胞是器官纖維化的起源細胞之一，在組織損傷后，Gli1+細胞轉化為活化狀態(tài)的成纖維細胞，介導纖維化的發(fā)生[5]。但是，導致Gli1+細胞表型轉化的機制尚不清楚。細胞所處的微環(huán)境是調節(jié)細胞代謝和表型轉化的重要因素，特別是其中的外泌體在細胞之間信息傳遞中發(fā)揮重要作用。心肌細胞是心臟組織中數(shù)量最多的細胞群體，其外泌體在心臟微環(huán)境調節(jié)以及Gli1+細胞表型轉化中的作用還不清楚。

外泌體是由細胞合成并分泌的攜帶多種物質(脂質、蛋白質、mRNA和非編碼RNA)的活性囊泡。它作為旁分泌效應的重要介質，可在生理病理條件下介導細胞、組織和器官之間的信息交流。已有研究表明，糖剝奪可以增加CMs中外泌體的合成和分泌[14]，提示心肌損傷后其生物學特性可能發(fā)生改變，其所分泌的外泌體內(nèi)容物也可能有所變化。為了探討病理(缺氧)條件下，CMs分泌的外泌體對Gli1+細胞纖維化表型轉變的作用，我們在體外缺氧條件下培養(yǎng)CMs，收集其上清提取外泌體(H-exo)，并將H-exo加入到Gli1+細胞中共培養(yǎng)。蛋白質印跡顯示，與陰性對照組相比，H-exo處理組的Gli1+細胞中纖維化相關蛋白α-SMA、DDR-2和Collagen I表達明顯增加，TGF-β陽性對照組的結果與之一致。流式細胞術結果也顯示，H-exo處理組的α-SMA和DDR-2雙陽性表達率明顯上調。以上結果均提示H-exo可以促進Gli1+細胞的纖維化。

在外泌體所有的內(nèi)容物中，microRNAs被證實調控多種心血管疾病的病理生理學過程，包括心肌細胞肥大、圍產(chǎn)期心肌病、糖尿病和敗血癥誘發(fā)的心肌病等[15]。microRNAs可以介導mRNA的切割，翻譯抑制或mRNA去穩(wěn)定化，并且通過與靶轉錄物中的3'端非翻譯區(qū)互補配對，是基因表達的主要調節(jié)因子。本研究結果發(fā)現(xiàn)，糖氧剝奪條件下可以改變CMs來源外泌體中某些與纖維化相關的miRNAs的含量，其中miR-223的變化最為明顯。提示H-exo中的miR-223可能對Gli1+細胞纖維化轉變起主要調節(jié)作用。轉染miR-223的mimic、inhibitors以及mimic nc和inhibitor nc，蛋白質印跡結果顯示，相對于陰性對照組，過表達miR-223后，Gli1+細胞中α-SMA、DDR-2和Collagen I的表達明顯增加，流式細胞術結果與之一致；而抑制miR-223后，Gli1+細胞中DDR-2的表達相應降低，α-SMA和Collagen I的表達沒有差異。綜上所述，H-exo與miR-223均可以促進Gli1+細胞纖維化表型轉換，提示H-exo可能主要通過其中的miR-223發(fā)揮促纖維化作用。

Fig 5 The fibrotic effect of miR-223 on Gli1+cells

以上實驗研究揭示了損傷心肌細胞通過其分泌的外泌體，促進心臟固有的Gli1+細胞的纖維化轉變，加速了受損心臟的纖維化進程。本研究揭示了Gli1+細胞纖維化表型轉換的機制，為闡明心臟纖維化發(fā)生的機制和新的治療手段的研發(fā)提供科學基礎。